(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210100598.6 (22)申请日 2022.01.27 (71)申请人 浙江迪福润丝生物科技有限公司 地址 310051 浙江省杭州市滨江区长河街 道滨安路68 8号2幢C楼6层6 01室 (72)发明人 孙慧敏　余飞　周孟云　毛水花　 方晨捷　宋家升　 (74)专利代理 机构 北京方圆嘉 禾知识产权代理 有限公司 1 1385 代理人 朱玲艳 (51)Int.Cl. C12N 7/01(2006.01) C12N 7/04(2006.01) C12N 15/44(2006.01) C12N 15/85(2006.01)C12N 15/11(2006.01) A61K 39/145(2006.01) A61P 31/16(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种流感病毒的致弱方法及流感致弱病毒 株和应用 (57)摘要 本发明涉及一种流感病毒的致弱方法及流 感致弱病毒株和应用， 属于生物医药技术领域。 本发明所述致弱方法包括： 对流感病毒保守区M2 蛋白跨膜结构域和细胞质结构域进行随机数量 和位置的碱基缺失， 获得具有相应碱基缺失的流 感致弱病毒。 本发明所述致弱方法获得的流感致 弱病毒株在表达M2蛋白的MDCK细胞系上具有良 好的生长特性； 较高剂量的病毒株可以在MDCK细 胞或鸡胚中生长且具有较高的鸡红细胞凝集价； 而且滴鼻免疫Balb/C小鼠， 发现相对于 亲本病毒 IAV PR8， 病毒株对小鼠是 非致病性的。 本发明随 机碱基缺失的方式降低了流 感病毒的毒力， 为更 加安全、 有效的IA V减毒活疫苗的筛 选奠定基础。 权利要求书1页 说明书8页 序列表5页 附图3页 CN 114381438 A 2022.04.22 CN 114381438 A 1.一种流感病毒的致弱方法， 包括以下步骤： 对流感病毒保守区M2蛋白跨膜结构域和 细胞质结构域进行随机数量和位置的碱基缺失， 获得 具有相应碱基缺失的流感致弱病毒。 2.根据权利要求1所述的致弱方法， 其特征在于， 所述致弱方法针对的亲本病 毒包括A/ Puerto Rico/8/1934。 3.根据权利要求1所述的致弱方法， 其特征在于， 所述随机数量和位置的碱基缺失选自 以下(a)～(f)中的一种： (a)缺失M2蛋白编码区第73～86位共14个碱基； (b)缺失M2蛋白编码区第87～10 6位共20个碱基； (c)缺失M2蛋白编码区第13 0～151位共2 2个碱基； (d)缺失M2蛋白编码区第152 ～189位共38个碱基； (e)缺失M2蛋白编码区第87～151位共6 5个碱基； (f)缺失M2蛋白编码区第87～189位共10 3个碱基。 4.权利要求1～3任一项所述致弱方法制备得到的流感致弱病毒株， 其特征在于， 所述 流感致弱病毒株以A/Puerto  Rico/8/1934为亲本病毒， 对M2蛋白进行以下(a)～(f)中的一 种碱基缺失： (a)缺失M2蛋白编码区第73～86位共14个碱基； (b)缺失M2蛋白编码区第87～10 6位共20个碱基； (c)缺失M2蛋白编码区第13 0～151位共2 2个碱基； (d)缺失M2蛋白编码区第152 ～189位共38个碱基； (e)缺失M2蛋白编码区第87～151位共6 5个碱基； (f)缺失M2蛋白编码区第87～189位共10 3个碱基。 5.根据权利要求4所述的流感致弱病 毒株， 其特征在于， 所述流感致弱病 毒株的M2蛋白 的编码区的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1、 SEQ  ID NO.2、 SEQ  ID NO.3、 SEQ  ID NO.4、 SEQ  ID  NO.5或SEQ  ID NO.6所示。 6.一组流感致弱病毒株构建用质粒， 其特征在于， 所述质粒分别含有如SEQ  ID NO.1、 SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.4、 SEQ  ID NO.5或SEQ  ID NO.6所示的核苷酸。 7.根据权利要求6所述的质粒， 其特征在于， 所述质粒构建时使用的基础质粒含如SEQ   ID NO.7所示的核苷酸序列。 8.构建权利要求6或7所述质粒用的引物， 其特征在于， 所述引物的核苷酸序列如SEQ   ID NO.8～19所示。 9.权利要求1～3任一项所述致弱方法或权利要求4或5所述的流感致弱病毒株或权利 要求6或7 所述的质粒或权利要求8所述的引物在制备流感减毒活疫苗中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114381438 A 2一种流感病毒 的致弱方 法及流感致弱病毒株和应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物医药技术领域， 具体涉及 一种流感病毒的致弱方法及 流感致弱病 毒株和应用。 背景技术 [0002]甲型流感(Influenza  A， IA)是一种高度传染性的急性呼吸道疾病， 由甲型流感病 毒(Influenza  Aviruses， IAV)引起， 是属于正粘病毒科的分节段负链RNA病毒。 疫苗接种是 预防IA感染的主要手段， 目前有灭活和减毒活疫苗。 由于黏膜免疫和细胞毒性T细胞反应有 限， 灭活疫苗的保护效果只能持续很 短的时间， 需要每年接种一次。 相反， IAV减毒活疫苗经 鼻免疫， 可引起强大的黏膜免疫和细胞免疫， 因此， 它们的保护作用可以持续更长的时间。 目前市场上只有两种减毒活疫苗， 而且均是基于冷适应特性的毒株， 这些疫苗的使用仅限 于2岁至49岁的人。 因此， 需要研发更加安全、 有效的减毒活疫苗抵抗 IA的感染。 发明内容 [0003]本发明的目的在于提供一种流感病毒的致弱方法及流感致弱病毒株和应用。 本发 明所述致弱方法获得的流感致弱病毒株(复制限制型病毒)可以在表达M2 蛋白的MDCK细胞 系上具有良好的生长特性， 而且相对于亲本病毒， 对小鼠是非致病性的， 能够为更加 安全、 有效的IAV减毒活疫苗的筛选奠定基础； 流感致弱病毒株还可以在MDCK细胞或鸡胚上良好 的生长， 高剂量的复制限制型病毒可以在MDCK细胞或鸡胚生长良好， 为利用鸡胚大量生产 致弱病毒提供 可能。 [0004]本发明提供了一种流感病毒的致弱方法， 包括以下步骤： 对流感病毒保守区M2蛋 白跨膜结构域和细胞质结构域进 行随机数量和位置的碱基缺 失， 获得具有相应碱基缺失的 流感致弱病毒。 [0005]优选的是， 所述 致弱方法针对的亲本病毒包括A/Puer to Rico/8/1934。 [0006]优选的是， 所述随机数量和位置的碱基缺失选自以下(a)～(f)中的一种： [0007](a)缺失M2蛋白编码区第73～86位共14个碱基； [0008](b)缺失M2蛋白编码区第87～10 6位共20个碱基； [0009](c)缺失M2蛋白编码区第13 0～151位共2 2个碱基； [0010](d)缺失M2蛋白编码区第152 ～189位共38个碱基； [0011](e)缺失M2蛋白编码区第87～151位共6 5个碱基； [0012](f)缺失M2蛋白编码区第87～189位共10 3个碱基。 [0013]本发明还提供了上述技术方案所述致弱方法制备得到的流感致弱病毒株， 所述流 感致弱病毒株以A/P uerto Rico/8/1934为亲本病毒， 对M2蛋白进行以下(a)～(f)中的一种 碱基缺失： [0014](a)缺失M2蛋白编码区第73～86位共14个碱基； [0015](b)缺失M2蛋白编码区第87～10 6位共20个碱基；说　明　书 1/8 页 3 CN 114381438 A 3