(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210098380.1 (22)申请日 2022.01.27 (71)申请人 淮阴师范学院 地址 223300 江苏省淮安市长江西路1 11号 (72)发明人 赵祥祥　刘福霞　刘磊　吴德鹏　 裔新　谷玉娟　毛丰　 (74)专利代理 机构 南京申云知识产权代理事务 所(普通合伙) 32274 专利代理师 邢少华　邱兴天 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 1/04(2006.01) (54)发明名称 一种与油菜种子次生休眠主效QTL共分离的 KASP和dCAPS标记及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种与油菜种子次生休眠主 效QTL共分离的KASP和dCAPS标记及其应用， 属于 油菜分子育种技术领域。 基于与油菜种子次生休 眠主效QT L qSSD.A09共分离的侧翼SNP标记A09_ 10470644的序列为基础序列， 设计KASP标记的引 物组合物和dCAPS标记的引物组合物， 以油菜植 株的基因组DNA作为模板进行PCR扩增， 使SNP标 记有效的转化为KASP标记和dCAPS标记。 利用本 发明所提供的检测体系和方法可以有效预测油 菜种子次生休眠特性， 辅助筛选具有弱次生休眠 特性优异品种或品系， 有效提高育种的准确性， 加速油菜种子次生休眠特性的改良。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 115029465 A 2022.09.09 CN 115029465 A 1.一种与油菜种子次生休眠主效QTL共分离的KASP标记和dCAPS标记， 其特征在于， 所 述KASP标记和dCAPS标记基于与油菜种子 次生休眠主效QTL  qSSD.A09共分离的侧翼SNP标 记A09_10470644的序列为基础序列， 设计KASP标记的引物组合物和dCAPS标记的引物组合 物， 以油菜植株的基因组DNA作为模板进行PCR扩增， 使SNP标记有效的转化为KASP标记和 dCAPS标记； 所述SNP标记与油菜种 子次生休眠相关的QTL  qSSD.A09共定位于油菜A09染色 体4.9cM的区间内， 位于中双11参考基因组A09号染色体10.47 ‑13.48Mb， 多态性为A/C； 所述 KASP标记的引物组合物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑3所示； 所述dCAPS标记的引物组合物 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4‑5所示。 2.一种与油菜种子次生休眠主效QTL共分离的KASP标记的引物 组合物， 其特征在于， 包 括用于对KASP标记进 行扩增的两条特异 性引物和一条通用引物， 引物的核苷 酸序列分别 如 SEQ ID NO.1‑3所示。 3.一种与油菜种子次生休眠主效QTL共分离的dCAPS标记的引物组合物， 其特征在于， 所述dCAPS标记的正向引物如SEQ  ID NO.4所示， 所述dCAPS标记的反向引物如SEQ  ID NO.5 所示。 4.权利要求1所述的与油菜种子次生休眠主效QTL共分离的KASP标记或权利要求2所述 的与油菜种子次生休眠主效QTL共分离的KASP标记的引物组合物在油菜种子次生休眠基因 遗传分析和精细定位中的应用。 5.权利要求1所述的与油菜种子次生休眠主效QTL共分离的KASP标记或权利要求2所述 的与油菜种子次生休眠主效QTL共分离的KASP标记的引物组合物在对油菜种子次生休眠特 性进行分子标记辅助育种中的应用。 6.权利要求1所述的与油菜种子次生休眠主效QTL共分离的dCAPS标记或权利要求3所 述的与油菜种子次生休眠主效QTL共分离的dCAPS标记的引物组合物在油菜种子次生休眠 基因遗传分析和精细定位中的应用。 7.权利要求1所述的与油菜种子次生休眠主效QTL共分离的dCAPS标记或权利要求3所 述的与油菜种子次生休眠主效QTL共分离的dCAPS标记的引物组合物在对油菜种子次生休 眠特性进行分子标记辅助育种中的应用。 8.一种筛选弱休眠基因型的油菜植株的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 以待测植株 样品的基因组DNA作为模板， 利用权利要求2所述的与油菜种子次生休眠主效QTL共分离的 KASP标记的引物组合物对模板进 行PCR扩增， 利用扩增结果进 行基因型分型； 所述引物组合 物中， SEQ  ID NO.1‑2所示的引物序列在5 ′端分别添加有不同的荧光修饰基团， 将能够读取 到SEQ ID NO.2所标记的荧 光基团的植株鉴定为弱休眠基因型的油菜植株。 9.一种筛选弱休眠基因型的油菜植株的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 以待测植株 样品的基因组DNA作为模板， 利用权利要求3所述的与油菜种子次生休眠主效QTL共分离的 dCAPS标记的引物组合物对模板进行PCR扩增， 使用限制性内切酶Taq  I对PCR产物进行酶切 并电泳检测， 根据电泳检测结果筛选弱 休眠基因型的油菜植株， 如果 酶切后片段为89b p， 则 为强休眠基因型的油菜植株， 如果酶切后片段为59bp和30bp， 则为弱休眠基因型的油菜植 株。 10.一种鉴定油菜种子次生休眠基因型的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求2所述的 KASP标记的引物组合物或权利要求3所述的dCAP S标记的引物组合物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029465 A 2一种与油菜种子次生休眠主 效QTL共分离的KASP和dCAPS标记 及其应用 技术领域 [0001]本发明属于油菜分子育种技术领域， 涉及一种SNP位点及基于其开发的分子标记 及其应用， 具体涉及一种与油菜种 子次生休眠主效QTL  qSSD.A09共分离的KASP和dCAPS标 记及其在油菜种子次生休眠特性进行辅助选择中的应用。 背景技术 [0002]油菜是世界上最重要的油料作物之一， 提供全球15％以上食用植物油， 同时也是 重要的生物燃料和饲料。 在油菜产区， 机械联合 收获时的机械行为会造成约6000 ‑9000粒/ m2的种子散落田间， 而人工收获还会造成更多的种子散落。 这些散落的种子因干旱等逆境 条件诱发次生休眠， 能够在地下存活几个月甚至十年之久， 造成地下种子库长期存在， 一旦 外界环境适宜， 这些次生休眠种子将会 萌发形成自生苗。 一方面， 油菜自生苗在田中会成为 杂草， 增加田间管理投入(人工、 除草剂等)； 另一方面， 油菜是常异 花授粉作物， 油菜自生苗 在开花期通过花粉漂流造成品种混杂， 导致油菜品质的降低。 更为严重的是， 转基因油菜自 生苗通过异交授粉还会导致基因漂流， 引发生物 安全问题。 培育和应用弱次生休眠新品种， 是解决这 一问题最经济有效的方式之一。 [0003]单核苷酸多态性(single  nucleotide polymorphism， SNP)指的是基因组内DNA某 一特定核苷酸位置上存在转换、 颠换、 插入、 缺失等变化而引起的DNA序列多态性。 SNP标记 具有数量多、 分布广泛、 在整个 基因组中分布均匀等优点已成为应用最广泛的分子标记。 [0004]KASP是由LGC公司(Laboratory  of the Government  Chemist)(http:// www.lgcgenomics.com)研发的竞争性等位基因特异性PCR技术(kompetitive  allele  specific  PCR， KASP)具有低成本、 高通量特点的新型基因分型技术， 通过引物末端碱基的 特异匹配来对SNP以及InDel标记进行精 准的双等位基因分型， 在水稻、 小麦、 大豆等作物的 分子标记辅助选择中得到广泛应用。 dCAPS(derived  cleaved amplified  polymorphic   sequences， dCAPS)分子标记技术利用突变形成 的酶切位点对突变位点扩增产物进行酶切 检测， 以判断突变情况。 该方法操作简单， 成本低， 结合聚合 酶链式反应(polymerase  chain  reaction， PCR)和琼脂糖凝胶电泳等常规实验室 设备即可完成基因分型。 [0005]前人通过连锁分析定位到4个与次生休眠相关的数量性状位点(quantitative   trait locus， QTL)， 分别位于A05、 C03、 C05和C08染色体上， 然而 并未开发与QTL紧密连锁， 可用于标记辅助选择育种的分子标记。 因此本研究利用开发的与油菜种子次生休眠相关的 主效QTL qSSD.A09共分离的KASP和dCAPS标记， 精准改良油菜种子次生休眠特性， 在油菜生 产实践中具有重要意 义。 发明内容 [0006]针对现有技术存在的上述问题， 本发明所要解决的第一技术问题在于提供一种与 油菜种子次生休眠主效QTL  qSSD.A09共分离的KASP和dCAPS标记； 本发明所要解 决的第二说　明　书 1/6 页 3 CN 115029465 A 3