(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210098821.8 (22)申请日 2022.01.27 (71)申请人 浙江理工大 学绍兴生物医药研究院 有限公司 地址 312000 浙江省绍兴 市越城区沥海街 道马欢路398号科技创业中心C号楼5 楼508室 申请人 浙江理工大 学 (72)发明人 何玉龙　卢科　舒建洪　 (74)专利代理 机构 浙江纳祺律师事务所 3 3257 专利代理师 王士祥 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01)G01N 33/569(2006.01) G01N 33/558(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/31(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (54)发明名称 一种猪肺炎支原 体nfo-RPA 检测试剂盒及其 制备方法 (57)摘要 本发明公开的是一种猪肺炎支原 体nfo‑RPA 检测试剂盒及其制备方法， 通过生物信息学分析 筛选出Mhp的P36基因保守序列， 从Mhp基因组中 扩增出P36基因并连接到pUC57质粒中构建P36 阳 性质粒， 根据 P36基因序列分别设计nfo ‑RPA酶扩 增引物Mhp ‑specific ‑Forward、 Mhp ‑specific ‑ Reverse和探针Mhp ‑specific ‑Probe， 将引物和 探针与nfo ‑RPA酶混合建立反应体系， 具有反应 重复性好， 检测特异性高， 反应结果快， 检测结果 与荧光定量PCR检测结果符合率为93.75%， 适用 于临床快检等 技术特点。 权利要求书2页 说明书6页 序列表1页 附图3页 CN 114480684 A 2022.05.13 CN 114480684 A 1.一种猪肺炎支原体nfo ‑RPA检测试剂盒， 其特征在于： 包括用于nfo ‑RPA酶扩增的引 物Mhp‑specific ‑Forward和Mhp ‑specific ‑Reverse， 与P36基因特异性结合的探针Mhp ‑ specific ‑Probe， P3 6阳性质粒， 试纸条。 2.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体nfo ‑RPA检测试剂盒， 其特征在于： 所述P36 阳性质粒序列如SEQ  ID NO.1所示。 3.根据权利 要求1或2所述的一种猪肺炎支原体nfo ‑RPA检测试剂盒， 其特征在于： 所述 Mhp‑specific ‑Forward序列为CCCTTGTAATTATATCAACAGGATTAGCAAC； 所述Mhp ‑specific ‑ Reverse序列为[Biotin]  TGCCTTTTCCGATTAGTGTCTCCCGTTATG； 所述Mhp ‑specific ‑Probe序 列为[FAM] GGTCTTCCCGCTGTAATTACAATAAAATCAGCAT[THF]CT TTTAGATCTTTATA[SpC]。 4.一种猪肺炎支原体nfo ‑RPA检测试剂盒的制备方法， 其特征在于该制备方法包括如 下步骤： 步骤一： 猪肺炎支 原体的培 养； 步骤二： P36阳性质粒的制备： 通过生物信息学分析筛选出Mhp的P36基因保守序列， 从 Mhp基因组中扩增出P3 6基因并连接 到pUC57质粒中构建P3 6阳性质粒； 步骤三： Mhp  nfo‑RPA反应体系的建立： 以P36保守序列为模板， 分别设计P36 ‑Forward 和P36‑Reverse两条引物从Mhp基因组中扩增出P36基因序列， 根据P36基因的序列分别设计 用于nfo‑RPA酶扩增的引物 Mhp‑specific ‑Forward和Mhp ‑specific ‑Reverse， 以及与P36基 因特异性结合的探针Mhp ‑specific ‑Probe， 将引物、 探针、 nfo ‑RPA酶混合建立反应体系， 获 得Mhp nfo‑RPA反应体系。 5.根据权利 要求4所述的一种猪肺炎支原体nfo ‑RPA检测试剂盒的制备方法， 其特征在 于： 还包括Mhp nfo‑RPA反应体系及条件 优化， 其包括如下步骤： 选取稀释浓度为2 ×108 copies/μL的P36质粒模板， 分别设置多个时间梯度进行nfo ‑ RPA扩增反应， 待反应结束后， 取出反应管置于冰上结束反应， 并在胶体金试纸条中观察结 果， 验筛可 见清晰的扩增条 带对应的最佳反应时间； 在上述筛选出最佳反应时间的基础上， 进一步设置多个温度梯度进行nfo ‑RPA扩增反 应， 并在胶体金试纸条中观察结果， 确定最佳反应温度。 6.根据权利 要求5所述的一种猪肺炎支原体nfo ‑RPA检测试剂盒的制备方法， 其特征在 于： 还包括Mhp nfo‑RPA反应体系灵敏度验证， 其包括如下步骤： 以P36阳性质粒标准品2 ×109 copies/ μL为初始浓度， 按10倍梯度稀释， 在最佳反应时 间和最佳反应温度条件下分别以稀释浓度为2 ×109 copies/ μL、 2 ×108 copies/ μL、 2 ×107  copies/ μL、 2 ×106 copies/ μL、 2 ×105copies/ μL、 2 ×104 copies/ μL、 2 ×103 copies/ μL、 2 ×102 copies/ μL、 2 ×101 copies/ μL、 2 ×100 copies/ μL的P36阳性质粒为模板， ddH2O为阴 性对照进行nfo ‑RPA扩增反应， 并在 胶体金试纸条中观察结果。 7.根据权利要求5或6所述的一种猪肺炎支原体nfo ‑RPA检测试剂盒的制备方法， 其特 征在于： 还包括Mhp  nfo‑RPA反应体系特异性鉴定， 其包括： 分别以Mhp 168株、 猪 圆环病毒2 型、 猪繁殖和呼吸道综合病毒、 猪流行性腹泻病毒、 非洲猪瘟病毒及伪狂犬病毒的基因组为 模板， ddH2O为阴性对照， 在最佳反应时间和反应温度条件下进行nfo ‑RPA反应， 并在胶体金 试纸条中观察结果； 还包括Mhp  nfo‑RPA反应体系重复性验证， 其包括组间重复、 组内重复， 其中， 组间重权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114480684 A 2复： 以2×107 copies/ μL、 2 ×106 copies/ μL、 2 ×105 copies/ μL  3个不同浓度的P36质粒在 同一条件下进行3次重复检测； 组内重复： 以2 ×107 copies/μL、 2 ×106 copies/μL、 2 ×105  copies/ μL  3个不同浓度的P3 6质粒在同一次实验中做3次重复。 8.根据权利 要求4所述的一种猪肺炎支原体nfo ‑RPA检测试剂盒的制备方法， 其特征在 于： 猪肺炎支原体的培养步骤为： 用改良Fr iis培养基溶解实验室鉴定冻存的Mhp或Mhp活疫 苗， 并以10  %的比例加 入到10 mL的改良Friis培养基中培养进行培养， 用双蒸水煮裂解法 提取Mhp株的基因 组； 改良Friis培养基由1.5  g脑心浸液粉， 1.6  g PPLO肉汤粉， 9  mL酵母浸液， 12.5  mL  Hank’s液， 50 mL猪血清， 5 mL 0.25%酚红， 50  mg/mL Amp混合， 定容至500  mL， 调节pH为7.4 后制备而得。 9.根据权利 要求4所述的一种猪肺炎支原体nfo ‑RPA检测试剂盒的制备方法， 其特征在 于： 步骤二具体为： 在NCBI数据库中查找Mhp  P36基因的序列， 通过生物信息学比对确定P 36 基因的保守序列， 以P36保守序列为模板， 分别设计P36 ‑Forward和P36 ‑Reverse两条引物从 Mhp基因组中扩增出P 36基因序列， 根据P36基因的序列分别设计用于nfo ‑RPA酶扩增的引物 Mhp‑specific ‑Forward和Mhp ‑specific ‑Reverse， 以及与P36基因特异性结合的探针Mhp ‑ specific ‑Probe； 利用分子生物学方法将扩增的P36基因进行双酶切后连接到pUC57载体 中， 转入Escherichia  coli TG1感受态菌中扩增， 筛选鉴定后获得的重组载体命名为P36阳 性质粒。 10.根据权利要求5或6或8所述的一种猪肺炎支原体nfo ‑RPA检测试剂盒的制备方法， 其特征在于： 步骤三具体为： 在nfo ‑RPA干粉管中分别加入29.4  μL Buffer A、 2 μL Mhp‑ specific ‑Forward、 2  μL Mhp‑specific ‑Reverse、 0.6  μL Mhp‑specific ‑Probe、 共13.5  μ L的ddH2O和P36阳性质粒， 2.5  μL 的Buffer  B， 在最佳反应温度条件等待最佳反应时间过 后， 取反应产物40  μL清洁回收后进行琼脂糖凝胶电泳， 其余10  μL产物稀释20倍后， 取50  μ L滴加到胶体金 试纸条加样孔中， 观察胶体金 试纸条的检测结果， d dH2O为阴性对照。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114480684 A 3