(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210103876.3 (22)申请日 2022.01.27 (71)申请人 南京农业大 学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 张亚丽　张玮　娄曼曼　漏佳婧　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 王艳 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C12N 15/84(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 5/00(2018.01)A01H 6/46(2018.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 水稻光敏色素蛋白突变型基因OsPHYA及其 应用 (57)摘要 本发明公开了一种水稻光敏色素蛋白突变 型基因OsPHYA， 所述水稻光敏色素蛋白突变型基 因OsPHYA 在野生型水稻光敏色素蛋白基因 OsPHYA的第179位插入碱基T或C或碱基A缺失。 本 发明还公开了突变型基因， 表达盒、 重组载体或 细胞在提高水稻对氮肥的利用率或改善水稻株 型或增加水稻产量方面的应用。 本发明公开的 OsphyA突变体材料（ OsphyA‑4、 OsphyA ‑6、 OsphyA‑17） 与野生相比单株生物量增加111.7%， N含量增加85.6%， 产量 提高42.2 %。 权利要求书1页 说明书14页 序列表4页 附图4页 CN 114480421 A 2022.05.13 CN 114480421 A 1.一种水稻光敏色素蛋白突变型基因 OsPHYA， 其特征在于， 所述水稻光敏色素蛋白突 变型基因 OsPHYA在野生型水稻光敏色素蛋白基因 OsPHYA的第179位插入碱基T或C或碱基A 缺失。 2.根据权利 要求1所述的水稻 光敏色素蛋白突变型基因 OsPHYA， 其特征在于， 其野生型 水稻光敏色素蛋白基因 OsPHYA核苷酸序列如SEQ  ID NO. 11所示。 3.表达盒、 重组载体或细胞， 其含有权利要求1或2所述的突变型基因 OsPHYA。 4.根据权利要求3所述的重组载体， 其特 征在于， 所述重组载体为pCXUN ‑Cas9 载体。 5.权利要求1或2所述的突变型基因， 权利要求3所述的表达盒、 重组载体或细胞在提高 水稻对氮肥的利用率或改善水稻株型或增 加水稻产量方面的应用。 6.一种获得高氮肥利用率同时具有高产量植物的方法， 其特征在于， 所述方法包括使 植物包含权利要求1或2所述的突变型基因。 7.根据权利要求6所述的获得高氮肥利用率同时具有高产量植物的方法， 其特征在于， 所述方法具体包括如下步骤： 1）OsPHYA基因的cDNA全长的获得； 2） 突变体材料pCXUN‑Cas9‑OsphyA的构建； 3） 转基因植株的获得。 8.根据权利要求7所述的获得高氮肥利用率同时具有高产量植物的方法， 其特征在于， 步骤2） 中突变体材料pCXUN ‑Cas9‑OsphyA的构建步骤如下： 在 OsPHYA基因的外显子区域设 计spacer序列， OsphyA以U3启动子序列为模板转录sgRNA， 将包含有sgRNA的水稻U3启动子 连接到已被Kpn Ⅰ单酶切的线性 化的pCXUN ‑Cas9 载体中即得。 9.鉴定植物的方法， 其中植物是包含权利要求1或2所述的突变型基因的植物或权利要 求6所述的方法获得的植物， 其特征在于， 所述方法包括测定所述植物是否包含1或2所述的 突变型基因。 10.根据权利要求9所述的鉴定植物的方法， 其特征在于， 所述鉴定方法中采用的引物 序列如SEQ  ID NO.5、 SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.7、 SEQ ID NO.8所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480421 A 2水稻光敏色素蛋白突变型基因OsPH YA及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及水稻光敏色素蛋白突变型基因OsPHYA及其应用， 属于植物基因工程技 术领域， 具体地讲 涉及水稻中编码光敏色素蛋白及其调控的基因应用。 背景技术 [0002]氮素既是蛋白质、 核酸以及叶绿素等关键有机分子 的基本组成元素， 也是植物生 长发育的主要限制因素之一， 氮素供应不足将导致植物体内新细胞形成受阻， 生长发育迟 缓， 产量下降。 植物在其 发育过程中需要足够的氮素营养， 然而我国大部 分土壤的有机质含 量比较低， 氮素供应不足， 因此， 施用氮肥成为增加作物产量、 改善农产品品质的重要农艺 措施。 然而， 值得注意的是， 所施的氮肥中只有50％或者更少的氮用于植物的生长发育和产 量构成， 其它50％或者更多通过挥发、 地表径流以及反硝化等途径在环境中损失(Camar go  et al.， 2005)。 这样不仅导致资源浪费， 更是造成了环 境污染， 如： 水体富营养化、 臭氧层破 坏以及温室效应等(Guo  et al.， 2010)。 因此， 筛选出氮高效水稻品种和对氮供应不敏感的 材料对于提高氮素利用效率、 减少氮肥浪费造成的污染具有重要意 义。 [0003]水稻是人们所依赖的主要的粮食作物 之一， 它也是研究单子叶植物分枝分子机制 的模型系统。 水稻分蘖是影响水稻产量的重要农艺性状之一， 它的形成受氮、 磷、 钾 等营养 元素的影响， 其中氮作为重要的环境因素影响水稻的生长和发育。 研究发现， 水稻分蘖和成 穗率与氮素的供应存在紧密的联系(林贤青等， 2005)。 Zhang等指出氮素从碳氮代谢和内源 激素合成两方面影响水稻的生长发育(张亚丽等， 2004)。 Xu等发现氮素与一些植物激素如 生长素、 细胞分裂素及独脚金内酯之间相互作用， 最终会对水稻分蘖的变化产生影响(Xu   et al.， 2005)。 氮素主要通过介导激素信号来调控水稻的分蘖进程， 和生长素一起通过控 制OsIPTs的表达量来影 响CTK的合成， 进而调控水稻分蘖的发育(潘寿， 2016)。 综上， 在养分 和植物激素共同调控分蘖中起重要的作用。 氮素相关基因硝酸根转运基因OsNPF7.2 正调控 了水稻对外界硝酸根的吸收和水稻体内硝酸根浓度， 进一步通过调控细胞分裂素与独脚金 内酯等激素途径， 影响了分蘖芽中细胞分裂的速度， 最终增加水稻分蘖数， 提高水稻产量 (Wang et al.， 2018)。 此外， 有研究表明GS1； 2能促进分蘖芽的向外伸长。 代谢分析揭 示了 GS1； 2在茎基部的蔗糖含量显著减少， 是由于OscFBP2基因表达下调， 导致其分蘖数减少。 因 此， 通过cFBPase2(胞质果糖 ‑1， 6‑二磷酸酶)合成蔗 糖来提供足够的蔗糖可能是水稻茎基 部分蘖生长所必需的， 表明分蘖的形成与代谢物的利用效率相关联(Miwa  Ohashi et a1.， 2018)。 [0004]随着人口的不断增长和耕地减少， 粮食短缺已成为全球最严峻的问题之一。 水稻 是重要的粮食作物之一， 全球有一半以上 的人口都把它作为主食， 因此提高水稻产量及 品 质为保障粮食安全具有重要意义。 分蘖的形成在某种程度上能使水稻增产。 分蘖的形成不 仅受内部影响， 也受外部因子的调控。 前文已提及在合理施氮范围内， 能促进分蘖的发生。 同时分蘖的发生受氮相关基因调控， 如GS1； 2通过改变代谢合成相关基因表达影响代谢产 物的合成， 进而影响其分蘖(Miwa  Ohashi et a1.， 2018)。 另外， 分蘖还受光照的影 响， 光不说　明　书 1/14 页 3 CN 114480421 A 3