(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210108808.6 (22)申请日 2022.01.28 (71)申请人 中国农业科 学院植物保护研究所 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 (72)发明人 彭焕　彭德良　邵蝴蝶　黄文坤　 孔令安　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11562 代理人 王颖 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) (54)发明名称 一种检测禾谷孢囊线虫的RPA引物和探针、 试剂盒及应用 (57)摘要 本发明公开了一种检测禾谷孢囊线虫的RPA 引物和探针、 试剂盒及应用， 属于植物寄生线虫 的检测领域。 所述RPA引物和探针， 其包括一对特 异性引物HaRPA ‑F3和HaRPA ‑R3， 以及一个探针 Ha‑probe， 其中， 所述HaRPA ‑F3和HaRPA ‑R3的核 苷酸序列如SEQ  ID NO:1‑2所示， 所述Ha ‑probe 的核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示。 利用上述RPA 引物和探针建立了禾谷孢囊线虫的快速可视化 检测方法， 且灵敏度高， 特异性强， 整个检测过程 可以在1小时内完成。 因此， 本发明RPA检测法是 一种简单、 快速、 特异、 灵敏度高和直观的方法， 可以适用于在田间快速 检测禾谷孢囊 线虫。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图4页 CN 114410802 A 2022.04.29 CN 114410802 A 1.一种检测禾谷孢囊线虫H.avenae的RPA引物和探针， 其特征在于， 包括一对特异性引 物HaRPA‑F3和HaRPA ‑R3， 以及一个探针Ha ‑probe， 其中， 所述HaRPA ‑F3和HaRPA ‑R3的核苷酸 序列如SEQ  ID NO:1‑2所示， 所述Ha ‑probe的核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示。 2.根据权利要求1所述的RPA引 物和探针， 其特征在于， 所述HaRPA ‑R3的5'末端标记生 物素。 3.根据权利要求1所述的RPA引 物和探针， 其特征在于， 所述Ha ‑probe的5'末端标记荧 光基团， 所述Ha ‑probe的5'末端和3'末端的中间加入一个四氢呋喃， 3'末端 标记修饰胺基、 磷酸基基团或C3‑Spacer亚磷酰胺。 4.一种检测禾谷孢囊线虫H.avenae的试剂盒， 其特征在于， 包括权利 要求1‑3任一项所 述的RPA引物和探针。 5.一种检测禾谷孢囊线虫H.avenae的方法， 其特征在于， 包括以待测 样品中提取的DNA 为模板， 利用权利要求1 ‑3任一项所述的RPA引物和 探针扩增， 电泳检测或侧流层析试纸条 检测判定是否含有禾谷孢囊线虫H.avenae。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 扩增反应体系为A  buffer29.4μL， 引物 HaRPA‑F3和HaRPA ‑R3各2 μL， 探针H a‑probe 0.6 μL， 模板DNA  2 μL， 11.5 μL  dd H2O， 2.5 μL B  buffer； 扩增条件为： 40℃保温12mi n， 4℃保存。 7.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 采用侧流层析试纸条检测时， 如果待测样 品为或者包含禾谷孢囊线虫样品， 在试纸条上呈现质量控制线和特异检测线两个条带， 反 之， 则只有质控线一条 带。 8.根据权利要求1 ‑3任一项所述的RPA引物和探针， 或权利要求5 ‑7任一项所述的方法 在制备检测 和/或鉴定禾谷孢囊线虫H.avenae 试剂盒中的应用。 9.根据权利要求1 ‑3任一项所述的RPA引物和探针， 或权利要求5 ‑7任一项所述的方法 在制备诊断禾谷孢囊线虫感染情况的试剂盒中的应用。 10.根据权利要求8 或9所述的应用， 其特征在于， 所述试剂 盒中包括凝胶电泳相关试剂 或侧流层析 试纸条。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410802 A 2一种检测禾谷 孢囊线虫的R PA引物和探针、 试剂盒及应用 技术领域 [0001]本发明涉及植物寄生线虫的检测领域， 特别是涉及一种检测禾谷孢囊线虫 H.avenae的RPA的引物和探针、 试剂盒及应用。 背景技术 [0002]禾谷类作 物孢囊线虫(Cereal  cyst nematodes)是严重影响小麦、 大麦、 燕麦等禾 谷作物的一大类孢囊线虫， 在世界主要小麦产区都有发生分布和 危害， 造成小麦的重大产 量损失， 其中最为严重的是禾谷孢囊线虫(Heterodera  avenae)、 菲利普孢囊线虫 (Heterodera  filipjevi)和麦类孢囊线虫(Heterodera  latipons)。 [0003]孢囊线虫的形态学差异非常小， 主要在于孢囊阴门锥的结构， 同时孢囊颜色、 囊 泡， 双膜孔的形状也有细微的差异， 但是这些差异需要丰富的专 业知识才能够区分， 在生产 实际中很难应用， 同时传统的形态学鉴定耗时较多， 工作量大， 很难满足目前高效快速和轻 简化检测的要求。 近年来， 随着分子生物学的快速发展， PCR等快速检测技术已经广泛的运 用到植物线虫的快速检测和鉴定中。 目前运用到孢囊线虫的检测技术主要包括ITS ‑RFLP， PCR， SCAR， RAPD， real  time PCR等。 在早期， 限制性片段长度多态性(RFLP)主要用于区分 H.avenae和H.filipjevi， 但是禾谷孢囊线虫的核糖体DNA(rDNA)中的ITS(内转录间隔区) 显示了种内群体的异质性和遗传多样性。 Qi等(2012)和Peng等(2 013)分别筛选出H.avenae 和H.filipjevi的SCAR标记引物， 可以直接从土壤和小麦根部检测出H.avenae和 H.filipjevi。 T oumi(2012)等人根据线粒体DNA(mtDNA)的COI序列设计了 特异性引物， 分别 检测多个国家和地区的H.avenae和H.filipjevi。 彭德良等(2003)扩增了中国小麦禾谷孢 囊线虫群体的核糖体基因的内转录间隔区， 用AluI和RsaI酶切ITS扩增产物证明中国禾谷 孢囊线虫ITS属于 “B型”， Hinf I酶切揭示出中国与摩洛哥禾谷孢囊线虫ITS之间存在明显 差异。 Yan等(2011)运用rDNA ‑ITS区域RFLP结合形态学鉴定的方法对美国部分地区的禾谷 孢囊线虫进行了检测， 该方法通过6种限制性内切酶能够有效的区分禾谷孢囊线虫和菲利 普孢囊线虫。 Fu等对中国黄淮海麦区的禾谷孢囊线虫进行了ITS和RFLP分析。 以PCR为基础 的分子鉴定方法一定程度上弥补了传 统形态鉴定上的缺陷。 但PCR检测需要PCR仪、 凝胶电 泳和成像系统(紫外仪)等昂贵的专 业仪器和分子生物学试剂， 且需要分子生物学专业 实验 人员操作， 以上检测只能在实验室条件下才可以检测， 需要较长的时间， 限制了PCR检测方 法在生产中的推广应用， 在禾谷孢囊线虫病发生分布调查和田间快速诊断过程中， 迫切需 要一种简便快捷的检测手段。 [0004]上述方法综合特点是反应时间长， 操作复杂， 需要昂贵的设备。 重组酶 聚合酶扩增 技术(Reco mbinase polymerase  amplificarion， RPA)更是被称为可替代PCR的核 酸检测技 术。 RPA技术是模拟 了生物体内DNA复制， 基于重组酶和聚合酶介导的扩增原理发展而来。 该 技术主要依赖于结合单链核酸(寡核苷 酸引物)的重组酶、 单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换 DNA聚合酶三种酶。 这3种酶的混合物在常温下即具有活性， 最佳反应温度在37℃ ‑42℃。 目 前， 虽然已有研究者将该方法应用到植物寄生线 虫的检测上， 但是使用RPA 技术检测土壤中说　明　书 1/7 页 3 CN 114410802 A 3