(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210106161.3 (22)申请日 2022.01.28 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114507743 A (43)申请公布日 2022.05.17 (73)专利权人 中国农业科 学院植物保护研究所 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 (72)发明人 彭德良　彭焕　邵蝴蝶　黄文坤　 孔令安　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 有限公司 1 1562 专利代理师 王颖 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 104928372 A,2015.09.23CN 110951838 A,2020.04.0 3 CN 10232 9793 A,2012.01.25 CN 111676296 A,2020.09.18 CN 110499370 A,2019.1 1.26 CN 110863058 A,2020.0 3.06 EP 19393 03 A1,2008.07.02 US 2021269858 A1,2021.09.02 CN 105705659 A,2016.0 6.22 Guiping Yan等.Species-Specific PCR Assays for Dif ferentiati ng Heterodera filipjevi and H. avenae. 《Plant Disease》 .2013,第97 卷(第12期),第161 1-1619页. 亓晓莉等.基 于SCAR标记的小麦禾谷孢囊 线 虫快速分子 检测技术. 《中国农业科 学》 .2012,第 45卷(第21期),第438 8-4395页. 彭德良等.国外甜菜孢囊 线虫发生 危害、 生 物学和控制技 术研究进 展. 《植物保护》 .2015,第 41卷(第5期),第1-7页. 审查员 高又文 (54)发明名称 一种快速检测菲利普孢囊线 虫的RPA引物和 探针、 试剂盒及应用 (57)摘要 本发明公开了一种快速检测菲利普孢囊线 虫的RPA引物和探针、 试剂盒及应用， 属于植物寄 生线虫的检测领域。 所述RPA引物如SEQIDN O:1‑2 所示和探针如SEQID  NO:3所示。 本发明利用RPA 引物和探针建立了RPA 检测菲利普孢囊线虫的方 法， 该方法灵敏度高， 特异性非常强， 检测阈值为 10‑3个二龄幼虫DNA， 10‑4个单孢囊DNA和0.01ng 基因组DNA， 灵 敏度是普 通PCR检测的100倍； 与常 见的密切相关的植物寄生线虫之间没有交叉反 应。 RPA整个检测过程可以在1小时内完成。 该检 测方法特异性强、 灵敏度高、 结果可视化、 快速、 准确， 在菲利普孢囊线虫病的早期诊断和田间检 测预警等方面具有很高的应用价 值。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图4页 CN 114507743 B 2022.11.25 CN 114507743 B 1.一种RPA引物和探针在制备诊断菲利普孢囊线虫侵染情况的试剂盒中的应用， 其特 征在于， 所述引物为： HfRPA‑F3:5'‑TTCAATTTGCCTTCTCCGCGTAAAGCGTATAG ‑3'； HfRPA‑R3:5'‑AAAAGTTATGGCTTCTCAAAGTTGGCCGCACC‑3'； 所述探针为： Hf ‑probe:5' ‑CGCCGAACTGGGTGGTCCCGTTTCCCAAGGGCGAACAGGAGAAGATTA GA‑3'； 所述HfRPA ‑R3的5 '末端标记生物素； 所述Hf‑probe 5'末端标记荧光基 团， 在所述Hf ‑probe的第34位碱基和第35位碱基中 间加入一个四氢呋喃， 3'末端标记修饰胺基、 磷酸基 基团或Spacer ‑C3亚磷酰胺。 2.一种检测 菲利普孢囊线虫的试剂盒， 其特征在于， 包含权利要求1中所述的RPA引物 和探针。 3.一种检测菲利普孢囊线虫的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 提取待测样品的DNA， 并以所述DNA为模板， 利用权利要求1中所述的RPA引物和探针扩 增， 通过检测扩增产物判定是否含有菲利普孢囊线虫， 所述方法是非诊断目的 的； 扩增反应条件为： 40℃保温12mi n， 4℃保存； 所述检测为电泳检测或者侧流层析 试纸条检测。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 扩增反应体系为： DNA模板2  .0μL， HfRPA ‑ F3和HfRPA ‑R3各2.0 μL， Hf ‑probe 0.6 μL， dd H2O 11.5 μL， 补足5 0 μl。 5.根据权利要求1中所述的RPA引物和探针在制备检测菲利普孢囊线虫的试剂盒中的 应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114507743 B 2一种快速检测菲利普 孢囊线虫的R PA引物和探针、 试剂盒及 应用 技术领域 [0001]本发明涉及 植物寄生线虫的检测领域， 特别是涉及一种快速检测菲利普孢囊线虫 的RPA引物和探针、 试剂盒及应用。 背景技术 [0002]禾谷类作 物孢囊线虫(Cereal  cyst nematodes)是严重影响小麦、 大麦、 燕麦等禾 谷作物的一大类孢囊线虫， 在世界主要小麦产区都有发生分布和 危害， 造成小麦的重大产 量损失， 其中危害最为严重的是禾谷孢囊线虫(Heterodera  avenae)、 菲利普孢囊线虫 (H.filipjevi)和麦类孢囊线虫(H.latipo ns)。 [0003]孢囊线虫的形态学差异非常小， 主要在于孢囊阴门锥的结构， 同时孢囊颜色、 囊 泡， 双膜孔的形状也有细微的差异， 但是这些差异需要丰富的专 业知识才能够区分， 在生产 实际中很难应用， 同时传统的形态学鉴定耗时较多， 工作量大， 很难满足目前高效快速和轻 简化检测的要求。 近年来， 随着分子生物学的快速发展， PCR等快速检测技术已经广泛的运 用到植物线虫的快速检测和鉴定中。 目前运用到孢囊线虫的检测技术主要包括ITS ‑RFLP, PCR， SCAR， RAPD， real  time PCR等。 在早期， 限制性片段长度多态性(RFLP)主要用于区分 H.avenae和H.filipjevi， 孢囊线虫的核糖体DNA(rDNA)中的ITS(内转录间隔区)显示了种 内群体的异质性和遗传多样性。 Qi等(2012)和Peng等(2013)分别筛选出禾谷孢囊线虫和菲 利普孢囊线 虫的SCAR标记引物， 可以直接从土壤和小麦根部检测出禾谷孢囊线 虫和菲利普 孢囊线虫。 Toumi(2012)等人根据线粒体DNA(mtDNA)的COI序列设计了特异性引物， 分别 检 测多个国家和地区的禾谷孢囊线 虫和菲利普孢囊线虫。 彭德良等(2003)扩增了中 国小麦禾 谷孢囊线虫群体的核糖体基因的内转录间隔区， 用AluI和RsaI酶切ITS扩增产物证明中国 禾谷孢囊线虫ITS属于 “B型”， Hinf I酶切揭示出中国与摩洛哥禾谷孢囊线虫ITS之间存在 明显差异。 Yan等(2011)运用rDNA ‑ITS区域RFLP结合形态学鉴定的方法对美国部分地区的 禾谷孢囊线虫进行了检测， 该方法通过6种限制性内切酶能够有效的区分禾谷孢囊线虫和 菲利普孢囊线虫。 Fu等对我国黄淮海麦区的禾谷孢囊线虫进行了ITS和RFLP分析。 以PCR为 基础的分子鉴定方法一定程度上弥补了传统形态鉴定上的缺陷。 但PCR检测需要PCR仪、 凝 胶电泳和成像系统(紫外仪)等昂贵的专 业仪器和分子生物学试剂， 且需要分子生物学专 业 实验人员操作， 以上检测只能在实验室条件下才可以检测， 需要较长的时间， 限制了PCR检 测方法在生产中的推广应用， 在小麦孢囊线虫病发生分布调查和田间快速诊断过程中， 迫 切需要一种简便快捷的检测手段。 [0004]上述方法综合特点是反应时间长， 操作复杂， 需要昂贵的设备。 重组酶 聚合酶扩增 技术(Reco mbinase polymerase  amplificarion， RPA)更是被称为可替代PCR的核 酸检测技 术。 RPA技术是模拟 了生物体内DNA复制， 基于重组酶和聚合酶介导的扩增原理发展而来。 该 技术主要依赖于结合单链核酸(寡核苷 酸引物)的重组酶、 单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换 DNA聚合酶三种酶。 这3种酶的混合物在常温下即具有活性， 最佳反应温度在37℃ ‑42℃。 研说　明　书 1/8 页 3 CN 114507743 B 3