(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210107971.0 (22)申请日 2022.01.28 (66)本国优先权数据 202111554800.4 2021.12.17 CN (71)申请人 广州白云山和记黄埔中药有限公司 地址 510515 广东省广州市白云区沙 太北 路389号 (72)发明人 夏静　郑夏生　李楚源　张慧晔　 李淑如　 (74)专利代理 机构 广州广典知识产权代理事务 所(普通合伙) 44365 代理人 万志香　曾银凤 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于杜鹃属物种鉴定的引物、 试剂盒和方法 (57)摘要 本发明涉及一种用于杜鹃属物种鉴定的PCR 扩增引物、 试剂盒以及方法， 所述引物选自以下 至少一对： SEQ  ID NO.19与SEQ  ID NO.20所示序 列， 或其互补序列； SEQ  ID NO.21与SEQ  ID  NO.22所示序列， 或其互补序列。 本发明的通过找 到适合杜鹃花属的鉴定的方法， 获得能签别杜鹃 花属的目的核酸位置， 并设置了理想的引物， 从 而能实现对杜鹃花属物种间的有效鉴别。 权利要求书1页 说明书14页 序列表5页 附图14页 CN 114410825 A 2022.04.29 CN 114410825 A 1.一种用于杜鹃属物种鉴定的PCR扩增引物， 其特 征在于， 其选自以下至少一对： SEQ ID NO.19与SEQ  ID NO.20所示序列， 或其互补序列； SEQ ID NO.21与SEQ  ID NO.22所示序列， 或其互补序列。 2.根据权利 要求1所述的用于杜鹃属物种鉴定的PCR扩增引物， 其特征在于， 所述PCR扩 增引物为SEQ  ID NO.21与SEQ  ID NO.22所示序列。 3.根据权利要求1或2所述的用于杜鹃属物种鉴定的PCR扩增引物， 其特征在于， 所述杜 鹃属物种为映山红亚属， 进一步包括岭南杜鹃Rhododendron  mariae Hance、 广东杜鹃 Rhododendron  kwangtungense  Merr.et Chun、 南昆杜鹃Rhododendron  naamkwanense   Merr.、 溪畔杜鹃Rhododendron  rivulare  Hand.‑Mazz.、 映山红Rhododendron  simsii  Planch.、 两广杜鹃Rhododendron  tsoi Merr.、 乳源杜鹃Rhododendron  rhuyuenense  Chun  ex Tam。 4.一种用于杜鹃属物种鉴定的试剂盒， 其特征在于， 其包括权利要求1或2所述的PCR扩 增引物。 5.权利要求1 ‑2任一所述的PCR扩增引物 的目的核酸扩增片段在杜鹃属物种鉴定中的 应用。 6.一种杜鹃属物种鉴定的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)对待鉴定杜鹃属物种的样本提取DNA； 2)对提成得到的DNA， 用权利要求1或2所述的PCR扩增引物进行扩增， 获得扩增产物； 3)对扩增产物进行分析。 7.根据权利要求6所述的杜鹃属物种鉴定的方法， 其特征在于， 扩增的温度和程序为： 95℃， 3mi n； 95℃， 15s， 5 6℃， 15s， 72℃， 15s， 3 5个循环； 72℃， 5mi n。 8.根据权利要求6所述的杜鹃属物种鉴定的方法， 其特征在于， 所述对扩增产物进行分 析， 包括： 测序， 序列拼接得到扩增子进行比对。 9.根据权利要求8所述的杜鹃属物种鉴定的方法， 其特征在于， 所述对扩增产物进行分 析， 还包括： 对扩增产物进行比对后建立进化 树。 10.根据权利要求8 或9所述的杜鹃属 物种鉴定的方法， 其特征在于， 所述对扩增产物进 行分析， 还包括： 对扩增产物进 行比对后， 导入基因多态性分析软件中进 行核苷酸多样性分 析。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410825 A 2用于杜鹃属物种鉴定的引物、 试剂盒和方 法 技术领域 [0001]本发明属于植物物种鉴定领域， 具体地， 涉及用于杜鹃属物种鉴定的引物、 试剂盒 和方法。 背景技术 [0002]传统的中药鉴别方法主要包括基原鉴定、 性状鉴定、 显微鉴定和理化鉴定。 这四种 方法主要依据药材 的表型特征进行鉴定， 而这些特征往往不仅受到遗传因素 的影响， 更与 生物体的生长发育阶段、 外部环境条件、 人类活动(如引种驯化、 加工炮制)等有密切关系， 从而具有很大 的变异性和可塑性， 也因此需要鉴定人员大量的积累和总 结， 导致该方法存 在主观性强、 重复性和稳定性差等 缺点。 [0003]近年来， 随着分子生物学技术在中药鉴定的渗透与发展， 基于DNA序列的分子鉴定 技术得到了迅速的发展和应用， 该方法与传统的中药鉴定方法相比较， 通用性 强、 鉴定结果 重复性好、 数据容 易整合、 便 于标准化推广。 [0004]中药分子鉴定技术主要包括3大类： 一是基于PCR的DNA指纹技术， 如RAPD等， 该方 法不需具备种属特异性， 不同的物种基因组可使用同一套引物分析， 但RAPD对反应条件非 常敏感， 实验结果重复性较差； 二是基于分子杂交的DNA鉴定技术， 如RFLP， 该方法所需DNA 量较大且对 纯度要求较高； 三是基于序列分析的DNA 鉴定， 如DNA条形码等技术， 是目前中药 鉴定中研究和应用最多的方法。 [0005]DNA条形码技术可以与全球生物DNA条形码数据库整合， 进行检索并准确鉴定， 同 时针对药材及基原的任何部位， 都具有非常好的适用性和重复性。 根据研究对象的DNA信息 是否已知， 基于PCR的分子鉴定技术分为随机简单限定引物PCR标记技术和特征引物的PCR 标记技术， 前者可通过特异条带法和聚类分析法实现中药材 的准确鉴定， 后者则需要获得 特异性鉴别条带。 位点特异性PCR技术属于后者， 在 《中国药典》 (2010版)已经收录， 目前在 石斛、 紫苏等植物 来源的中药材鉴别中也得到广泛应用。 其方法原理简单概括如下： 首先针 对已知待鉴别中药与混伪品基因序列进行比对分析， 在确定正品的特异变异位点后， 设计 引物是将该位点的互补碱基设计在引物3 ‘端的最末端， 这样正品可以扩增出特异 性突变位 点的基因扩增片段， 但混伪品不能， 从而实现真伪鉴别(韩建萍,宋经元,姚辉,等.中药材 DNA条形码鉴定的基因序列比较[J].中国中药杂志,2012,37(08):10 56‑1061)。 [0006]DNA条形码技术基于通用的DNA片段和充 分样本取样， 通过两两比较种类变异和中 间变异的Barcoding  Gap(遗传间隔)， 对物种进行区分。 陈士林等学者建立了以ITS2为核心 序列、 trnH ‑psbA为补充序列的植物类药材DNA条形码鉴定体系。 中国植物条形码研究组分 析发现， ITS与matK、 rbcL和psbA ‑trnH三个叶绿体DNA条形码片段任一组合可有 效区分70 ‑ 79％的物种(郑硕理,田晓玲,黄承玲,等.结合分子手段和形态分析验证大白杜 鹃与马缨杜 鹃的自然杂交[J].生物多样性,2017,25(0 6):627‑637.)。 [0007]中国是世界杜鹃花的起源和分布中心， 杜鹃花野生资源品种丰富， 光是特有种就 有409种。 但杜鹃花属植物种类繁多， 部分种间亲缘关系较近， 且自然界普遍存在自然杂交说　明　书 1/14 页 3 CN 114410825 A 3