(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210109297.X (22)申请日 2022.01.28 (71)申请人 广州血康陆道培生物技 术有限公司 地址 510700 广东省广州市黄埔区崖鹰石 路10号B415 (72)发明人 胡斌　王军　刘刚　郑若楠　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 赵崇杨 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测E2A -ZNF384融合基因的引物组、 试 剂盒及方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测E2A ‑ZNF384融合基 因的引物组、 试剂盒及方法。 所述引物组包括一 对外引物、 一对内引物和一条探针， 外引物采用 锁核酸标记， 内引物用于在外引物扩增基础上进 行嵌套式扩增， 同时通过探针进行荧光PCR信号 收集， 极大提高检测的灵敏度和特异性， 其检测 灵敏度达到1 ×101copies/mL， 相当于可以稳定 地达到每106个有核细胞中检出一个含E2A ‑ ZNF384融合基因的白血病细胞； 内外引物的Tm值 落差保证了外扩增、 内扩增反应在一个 反应体系 内分别独立进行， 无需中途开盖增加污染风险、 无需进行两次独立的PCR反应， 简单、 快捷， 2小时 内即可得到检测结果， 从而满足白血病早期诊 断、 早期治 疗的要求。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图2页 CN 114480649 A 2022.05.13 CN 114480649 A 1.一种检测E2A ‑ZNF384融合基因的引物组， 其特征在于， 包括一对外引物、 一对内引物 和一条探针； 所述外引物的上游引物序列为5 ’ ‑agCagcAcGtttgGtggcct ‑3’， 下游引物序列 为5’‑ctcCaGcAgtCAtcaGtcCtg ‑3’； 所述内 引物的上游引物序列为5 ’‑ atggagcagaggtgaacggt ‑3’， 下游引物序列 为5’ ‑aggcaggcactgtcagcaa ‑3’； 所述探针序列 为5’ ‑cccacagtctcaggtcagatc‑3’， 5端’标记荧光基团， 3 ’标记淬灭基团。 2.根据权利要求1所述引物组， 其特征在于， 所述荧光基团选自FAM、 VIC、 HEX、 Cy5中的 任意一种。 3.根据权利要求1所述引物组， 其特征在于， 所述淬灭基团选自TAMRA、 Cy3、 BHQ1中的任 意一种。 4.权利要求1～3任一所述引物组在非疾病诊断目的检测E2A ‑ZNF384融合基因或在制 备检测E2 A‑ZNF384融合基因的产品中的应用。 5.一种检测E2A ‑ZNF384融合基因的产品， 其特征在于， 包含权利要求1～3任一所述引 物组。 6.根据权利要求5所述产品， 其特征在于， 还包含PCR反应液、 PCR反应酶系、 E2A ‑ZNF384 融合基因阳性质控品以及阴性质控品。 7.权利要求5或6所述产品在非疾病诊断目的检测E2 A‑ZNF384融合基因中的应用。 8.一种非疾病诊断目的检测E2 A‑ZNF384融合基因的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1.提取样品RNA； S2.将步骤S1所述样品RNA反转录成cDNA模板或直接以步骤S1所述样品RNA为模板， 利 用权利要求1～3任一所述引物组进行一 步巢式荧光定量PCR扩增反应； S3.结果判定： 通过扩增曲线进行判定， 若扩增曲线呈明显单一S型曲线， 则判定样品中 有E2A‑ZNF384融合基因。 9.根据权利 要求8所述方法， 其特征在于， 所述一步巢式荧光定量PCR扩增体系为2 μM外 引物0.8 μL， 20 μM内引物0.8 μL， 20 μM探针0.4 μL， 5 ×一步法RT ‑PCR缓冲液5 μL， 热启动酶2U， MMLV酶100U， dNTPs 25mM 0.6 μL。 10.根据权利要求8所述方法， 其特征在于， 所述一步巢式荧光定量PCR扩增程序为50℃ 15min； 95℃3mi n； 95℃15sec， 72℃3 0sec， 15个 循环； 再95℃5sec， 58℃15sec， 40个 循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480649 A 2一种检测E2A ‑ZNF384融合基因的引物组、 试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明涉及医学检测技术领域， 更具体地， 涉及一种检测急性B细胞淋巴细胞白血 病E2A‑ZNF384融合基因的引物组、 试剂盒及方法。 背景技术 [0002]急性B细胞淋巴细胞白血病(B ‑cell acute lymphoblastic  leukemia， B ‑ALL)是 一种异质性血液系统疾病， 其特点是淋巴分化受阻、 不成熟、 无功能的B细胞克隆迅速增殖。 其临床症状主要包括贫血、 肝脾肿大、 关节疼痛以及 全身淋巴结肿大等。 约有30％～60％的 患者表现为难治性或复发性， 这也是导致B ‑ALL患者死亡的主要原因。 B ‑ALL在治疗中存在 化疗后缓解率低、 复发率高以及长期生存率差等问题， 目前B ‑ALL的诊治对人类来说仍然 是 一个严峻的挑战。 如果未经早期诊断并治疗， 疾病会迅速发展， 可在数周至数月内致命， 目 前主要根据细胞 形态学、 免疫分型和遗传特 征对B‑ALL进行综合诊断。 [0003]随着分子生物学技术的发展及对白血病分子遗传学的深入研究， 已知白血病中存 在着染色体结构畸变， 包括缺失、 重复、 倒位、 易位等， 涉及至少数十种融合基因， 融合基因 形成是白血病的发生和发展的重要机制， 对相关融合基因检测， 可以达到精准诊断的目的， 同时融合基因的定性和定量分析还可以作为预后评估的有效手段， 在形态学完全缓解的基 础上， 使诊断更加准确。 [0004]最近的研究表明， 急性B细胞淋巴细胞白血病患者染色体畸变， 导致锌指蛋白 ZNF384基因和转录因子3( TCF3 or E2A)基因断裂易位形成E2A ‑ZNF384融合基因， E2A ‑ ZNF384融合基因阳性在B ‑ALL病人中占比2.4％， 且在治疗后 是最容易复发的类型。 目前检 测融合基因mRNA表达的方法有高通量转录组测序分析、 Northern  blot、 荧光原位杂交 (FISH)和实时荧光定量PCR(qPCR)。 A.高通量转录组测序分析可对细胞mRNA及非编码RNA进 行整体测序分析， 能够一次性分析已知的白血病相关融合基因及基因表达谱， 但这样技术 仅能用于科研， 费用高昂、 耗时极长， 仅后续生物信息学分析就需一周时间， 而且不能针对 一个位点， 是一种 “大撒网”式技术， 不能应用于临床快速检测。 B.Northern  blot采用琼脂 糖凝胶电泳， 在变性条件下将待检的RNA样品通过印迹转移至固相支持物如纤维素膜等上 面， 在用标记过的cDNA探针， 根据碱基互补原则进行杂交后显影， 显示强度可表明RNA在所 测样本中的相对含量。 缺点是灵敏度低、 信号弱， 纤维素膜显示后有高背景， 影响判断。 C.FISH是一种非放射性原位杂交技术， 将cDNA片段标记上生物素等报告分子， 通过杂交后 报告分子与亲和素之间的免疫化学反应， 在荧光显微镜下对待测RNA进 行定性或定位分析。 它的优点是定位准确、 荧光信号强。 缺点是杂交不能达到100％的效率， 特别是在应用较短 的cDNA探针时效率会明显下 降， 容易造成漏检， 同时因为是通过荧光显微镜观察， 主观性 强， 对操作人员的技术要求高， 很难在医院大规模应用。 而实时荧光定量PCR(qPCR)具有快 速、 精准的检测融合基因的优点， 可应用于临床快速检测， 例如中国专利CN111321227A、 CN12522403A、 CN1118263 75A、 CN1136842 61A等分别公开了针对E2A ‑ZNF384融合基因的多重 荧光PCR或荧光PCR技术， 但由于E2A ‑ZNF384融合基因在病程早期表达量极低， 目前的技术说　明　书 1/7 页 3 CN 114480649 A 3