(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210107725.5 (22)申请日 2022.01.28 (71)申请人 西安启晟医药 科技有限公司 地址 710000 陕西省西安市高新四路高新 大都荟第7幢1单 元22层2204 (72)发明人 李冰琳　龙兴宏　 (74)专利代理 机构 西安知诚思 迈知识产权代理 事务所(普通 合伙) 61237 专利代理师 高喜凤 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于宫颈脱落细胞甲基化快速检测的试剂 盒及其检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于宫颈脱落细胞甲基 化快速检测的试剂盒及其检测方法， 所述试剂盒 包括引物探针组合物、 酶切扩增缓冲液、 甲基化 敏感限制性内切酶和无核酸 酶水， 所述引物探针 组合物包括ZNF671引物和探针、 PAX1引物和探 针、 FAM19A4引物和探针、 A CTIN引物和探针， 使用 该试剂盒对宫颈脱落细胞进行检测， 检测结果灵 敏度和特异性 好， 检测过程简单、 耗时短。 权利要求书2页 说明书11页 序列表3页 附图5页 CN 114480648 A 2022.05.13 CN 114480648 A 1.用于宫颈脱落细胞甲基化快速检测的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括引物探 针组合物、 酶切扩增缓冲液、 甲基化敏感限制性内切酶和无核酸酶水； 所述引物探针组合物包括ZNF671引物对、 ZNF671荧光探针、 PAX1引物对、 PAX1荧光探 针、 FAM19 A4引物对、 FAM19 A4荧光探针、 ACTI N引物对和ACTI N荧光探针。 2.根据权利要求1所述的用于宫颈脱落细胞甲基化快速检测的试剂 盒， 其特征在于， 所 述ZNF671引物对的序列如SEQ  ID NO.1‑2所示， ZNF671荧光探针 的序列如SEQ  ID NO.3所 示； 所述PAX1引物对的序列如SEQ  ID NO.4‑5所示， PAX1荧光探针的序列如SEQ  ID NO.6所 示； 所述FAM19A4引物对的序列如SEQ  ID NO.7‑8所示， FAM19A4荧光探针的序列如SEQ  ID  NO.9所示； 所述ACTIN引物对的序列如SEQ  ID NO.10‑11所示， ACTIN荧光探针的序列如SEQ  ID  NO.12所示。 3.根据权利要求1所述的用于宫颈脱落细胞甲基化快速检测的试剂 盒， 其特征在于， 所 述ZNF671荧光探针、 PAX 1荧光探针、 FAM19A4荧光探针、 ACTIN荧光探针上的荧光报告基团均 选自FAM、 H EX、 ROX、 VIC、 C Y5、 5‑TAMRA、 TET、 C Y3、 NED、 Texas  Red或JOE； 所述ZNF671荧 光探针、 PAX1荧 光探针、 FAM19 A4荧光探针的荧 光报告基团相同或不同； 所述ACTIN荧光探针的荧光报告基 团与ZNF671荧光探针、 PAX1荧光探针、 FAM19A4荧光 探针的均不相同。 4.根据权利要求1所述的用于宫颈脱落细胞甲基化快速检测的试剂 盒， 其特征在于， 所 述酶切扩增缓冲液包括40mmol/L  Tris‑HCl、 200mmol/L KCl、 40mmol/L MgCl2、 0.4mg/mL重 组白蛋白、 0.6％海藻糖、 1.5m mol/L HS Taq酶、 1m mol/L dNTP。 5.根据权利要求1所述的用于宫颈脱落细胞甲基化快速检测的试剂 盒， 其特征在于， 所 述甲基化敏感限制性内切酶选自AatII、 AccI、 AciI、 AgeI ‑HF、 BaeI、 BglI、 BsaAI、 HaeII、 HhaI、 HinfI、 HpaII、 Hpy166II、 HpyCH4IV、 NheI、 NheI ‑HF、 NotI、 NotI ‑HF、 SacI‑HF、 SalI、 SalI‑HF、 SrfI、 Tfifi I、 BstUI中的一种或多种。 6.使用如权利要求1～5任一项所述的用于宫颈脱落细胞甲基化快速检测的试剂盒进 行甲基化检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤S1， 分别量取酶切扩增 缓冲液、 引物探针组合物和无核酸酶水， 涡旋振荡15s使其 充分混匀， 将混合液分装至PCR反应管中； 步骤S2， 在混合液中加入 甲基化敏感限制性内切酶， 吹打均匀后， 加入底物DNA组成反 应体系， 进行酶切、 PCR扩增， 并对 扩增产物进行甲基化检测。 7.根据权利要求6所述甲基化检测方法， 其特征在于， 所述反应体系总体积为25μL， 包 括7.5 μL酶切扩增缓冲液、 6 μL引物探针组合物、 7.5 μL无核酸 酶水、 2 μL甲基化敏感限制性内 切酶和2 μL底 物DNA； 所述引物探针组合物中各引物对和荧光探针的终浓度为0.3μmol/L ‑1.5μmol/L， 所述 甲基化敏感限制性内切酶的浓度为2.5U/ μL ‑12.5U/ μL， 所述底物DNA的质量浓度为2.5ng/ μ L‑250ng/ μL。 8.根据权利 要求7所述甲基化检测方法， 其特征在于， 所述PCR扩增过程如 下： 37℃反应权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114480648 A 220min， 95℃预变性5mi n， 95℃10s、 6 0℃30s， 45个循环。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114480648 A 3