(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210110992.8 (22)申请日 2022.01.29 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114107372 A (43)申请公布日 2022.03.01 (73)专利权人 中国农业科 学院生物技 术研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人 姜凌　张春义　任莹　连通　 刘吉安　 (74)专利代理 机构 北京诚呈知识产权代理事务 所(普通合伙) 11883 专利代理师 杨凌波 (51)Int.Cl. C12N 15/82(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 1/21(2006.01)A01H 5/10(2018.01) A01H 6/46(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 US 2010035307 A1,2010.02.1 1 CN 101454 460 A,2009.06.10 US 2016017354 A1,2016.01.21 CN 109652351 A,2019.04.19 CN 101291590 A,20 08.10.22 CN 109055289 A,2018.12.21 NCBI.PREDICTED : Zea mays 5 - methyltetrahydropteroyltriglutamate- - homocystei ne methyltransferase 1 (LOC541714), transcript variant X2, mRNA. 《NCBI Reference Sequence: XM _ 008646413.4》 .2020,origi n. 审查员 李有朝 (54)发明名称 一种通过基因敲除提高籽粒甲硫氨酸含量 的方法 (57)摘要 本发明公开了一种通过基因敲除提高籽粒 甲硫氨酸含量的方法。 通过CRISPR/Cas9技术对 玉米ZmMETS2 实施基因敲除， 发现该基因敲除后 玉米籽粒中甲硫氨酸含量得到一定程度的提高。 本发明中玉米 ZmMETS2的CRISPR/Cas9靶标位点 的设计以及该基因的功能能够显著影响甲硫氨 酸含量的发现， 不仅为该基因在 玉米和其他作物 中CRISPR研究提供了 借鉴， 还为玉米和其他作物 的甲硫氨 酸代谢提供了理论基础， 通过提高转基 因植物的甲硫氨酸含量， 缓解人类在氨基酸营养 方面的不足。 权利要求书1页 说明书5页 序列表6页 附图4页 CN 114107372 B 2022.07.29 CN 114107372 B 1.一种通过基因敲除提高籽粒甲硫氨酸含量的方法， 其特征在于， 所述方法是对玉米 ZmMETS2基因进行敲除突变， 获得籽粒甲硫氨酸含量 提高的玉米植株。 2.根据权利要求1所述通过基因敲除提高籽粒甲硫氨酸含量的方法， 其特征在于， 所述 基因敲除的过程为： 构建含有玉米 ZmMETS2 基因靶标序列的重组基因CRISPR/Cas9敲除载 体， 转化野生型玉米自交系， 对玉米的基因 ZmMETS2进行突变； 所述靶标序列的核苷酸序列 如序列表SEQ  ID NO.3所示。 3.根据权利要求2所述通过基因敲除提高籽粒甲硫氨酸含量的方法， 其特征在于， 所述 CRISPR/Cas9敲除载体的引物包括Primer3和Pri mer4， 其核苷酸序列如序列表SEQ  ID NO.6 和SEQ ID NO.7所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114107372 B 2一种通过 基因敲除提高籽粒 甲硫氨酸含量的方 法 技术领域 [0001]本发明属于基 因工程及分子生物学技术领域， 具体涉及 一种通过基因敲除提高籽 粒甲硫氨酸含量的方法。 背景技术 [0002]甲硫氨酸属于人体和单胃动物无法合成的必需氨基酸， 必须从饮食中摄取。 一方 面甲硫氨酸是蛋白质的基本组成氨基酸， 其密码子作为启动蛋白质mRNA翻译的起点； 另一 方面甲硫氨酸通过其主要分解代谢产物S ‑腺苷蛋氨酸间接调节多种细胞过程， 包括DNA和 蛋白质甲基化、 细胞增殖和分化、 凋亡、 内环境稳定和基因表达等。 特别是在植物种子发育 和萌发过程中， 甲硫氨酸也非常重要。 动植物体内甲硫氨酸的合成途径至少有2种。 一种途 径是以多尾形式的5甲基四氢叶酸和同型半胱氨酸尾底物、 在甲硫氨酸合酶的作用下形成 甲硫氨酸和四氢叶酸； 另一种途径， 在动物中是以胆碱为来源的甜菜碱为底物， 在甜菜碱同 型半胱氨 酸S‑甲基转移酶的作用下形成甲硫氨酸， 在植物中是以S ‑甲基蛋氨 酸为和同型半 胱氨酸为底物， 在同型半胱氨酸甲基转移酶作用下形成甲硫氨酸。 然而， 在农作物， 特别是 豆类植物的种子中发现甲硫氨酸含量相对较低， 从而限制 了它们的营养质量， 以植物为主 的膳食， 其甲硫氨 酸的含量只有平衡膳食 所需量的50 ‑75%。 在以素食为主的文化中， 或在植 物源性食物占主导地位的发展中 国家， 作物中低的甲硫氨酸含量可能导致人类蛋白质缺乏 的非特异 性反应， 例如降低对疾病的抵抗力， 降低血液蛋白质， 以及幼儿智力和身体发育迟 缓。 同时， 由于甲硫氨酸是人体甲基的四种主要膳食来源之一， 其缺乏也会导致甲基化相关 疾病 （例如脂肪肝、 动脉粥样 硬化、 神经系统疾病和肿瘤） 的发生。 因此通过提高作物种子的 甲硫氨酸含量可以缓解人类在氨基酸营养方面的不足。 [0003]基因组编辑技术是研究植物基因功能和农作物品种改良强有力的手段之一。 其 中， CRISPR/Cas9是一种用于靶标基因特定DNA修饰的工具， 因其高效、 便捷、 适用范围广而 成为当今最热门的基因编辑技术。 CRISPR/Cas9系统主要由引导RNA （sgRNA） 和Cas9蛋 白结 构域组成， 在识别、 切割目标DNA双链后， 通过同源重组或非同源末端 连接修复途径产生DNA 突变。 该技术不仅可研究、 鉴定和筛选与重要性状相关的基因， 还能更准确快速地设计、 改 造作物品种， 同时可有针对性地聚合多个优良性状， 以提高植物的抗性、 产量或品质。 通过 基因编辑的手段提高植物 氨基酸含量已成为目前生物强化的主 要手段之一。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供通过一种通过基因敲除提高籽粒甲硫氨酸含量的方法。 [0005]为了实现本发明 目的， 本发明利用基因编辑技术， 对玉米中编码甲硫氨酸合酶2的 基因ZmMETS2（该基因所在位点的编号为GRMZM2G112149， 参考玉米基因组B72  RefGen_v2） 进行敲除突变， 背景材料来源于自交系B104， 扩增CDS序列引物对为Primer1(SEQ  ID  NO.4)/Primer2(SEQ  ID NO.5)， 其CDS序列为SEQ  ID NO.1， 编码 的氨基酸序列为SEQ  ID  NO.2， 具体优选的敲除突变靶位 点为SEQ ID NO.3。说　明　书 1/5 页 3 CN 114107372 B 3