(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210110189.4 (22)申请日 2022.01.29 (71)申请人 中国农业科 学院植物保护研究所 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 申请人 陕西省生物农业研究所 (72)发明人 彭焕　彭德良　刘恩良　黄文坤　 李英梅　常青　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11562 代理人 王颖 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种快速检测鳞球茎线 虫的引物、 试剂盒及 应用 (57)摘要 本发明公开了一种快速检测鳞球茎线虫的 引物、 试剂盒及应用， 属于植物线虫分子检测技 术领域。 所述引物为特异性引物Dp ‑482F和Dp ‑ 829R， 其核苷酸序列如下： Dp ‑482F:5 ’‑ GCTGCGTTGAAGAGAACTGGCAC ‑3’， Dp‑829R:5’ ‑ CGGAAAAGCACCCAACCAGTACC ‑3’， 该引物能特异性 检测鳞球茎线虫； 本发明还利用该特异性引物构 建了检测鳞球茎线虫的方法， 该特异性引物和方 法的检测阈值高达10pg/μL基因组DNA和1/128 头线虫。 因此， 本发明的引物灵敏度高， 特异性 强， 在鳞球茎线虫的早期 诊断和快速检测和预警 等方面具有很高的应用价 值。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图3页 CN 114410803 A 2022.04.29 CN 114410803 A 1.一种快速检测鳞球茎线虫的引物， 其特征在于， 所述引物为特异性引物Dp ‑482F和 Dp‑829R， 其核苷酸序列如下： Dp‑482F:5’ ‑GCTGCGTTGAAGAGAACTGGCAC‑3’， Dp‑829R:5’ ‑CGGAAAAGCACCCAACCAGTACC‑3’。 2.一种快速检测鳞球茎线虫的产品， 其特 征在于， 包括权利要求1所述的引物。 3.根据权利要求2所述的产品， 其特 征在于， 所述产品包括试剂盒、 试剂。 4.一种快速检测鳞球茎线虫的方法， 其特征在于， 包括利用权利要求1所述的引物扩增 待测样品目的基因片段的步骤。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于扩增的反应体系为： 10 ×PCR Buffer 2.5μ L， 10mM dNTP 2 μL， Taq酶0.5 μL， 引物Dp ‑482F和Dp ‑829R各1.0 μL， DNA  模板1 μL， 无菌蒸馏水 补充至25 μL。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 扩增条件为： 94℃， 5min； 94℃30s， 56℃， 30s， 72℃， 1mi n， 35个循环； 72℃， 10mi n， 4℃保存。 7.一种根据权利要求1所述的引物在制备检测鳞球茎线虫 试剂或者试剂盒中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410803 A 2一种快速检测鳞球茎线虫的引物、 试剂盒及应用 技术领域 [0001]本发明涉及 植物线虫分子检测技术领域， 特别是涉及一种快速检测鳞球茎线虫的 引物、 试剂盒及应用。 背景技术 [0002]鳞球茎茎线虫(拉丁名为Ditylenchus  dipsaci(Kuhn,1987)Filijev)又称起绒草 茎线虫， 作为一种破坏性寄生线 虫， 拥有近500多种寄主种类， 主要为害部位是茎组织， 也对 块状茎、 鳞茎、 球茎以及根状茎等部位有很大危害。 该线虫的为害能造成很多农作物的减 产， 更严重者， 能造成植株坏死。 20年代， 鳞球茎茎线 虫使英国水仙种植业几乎毁灭， 据报道 在水仙上一个生长季节鳞球茎茎线虫可以增15000倍， 能使整个鳞茎迅速毁坏。 此外， 鳞球 茎茎线虫严重危害甜菜， 并在寄主内大量繁殖， 逐渐形成腐烂病， 导致贮藏根系数腐坏。 少 量的鳞球茎茎线虫也能造成极大危害。 研究表明， 如果有每500g土壤1条线虫的存活量， 该 线虫即能造成洋葱 等植株的减产。 一 旦其存在于 土壤中， 即可 大量繁殖， 非常难以根除。 [0003]在茎线虫的分子检测中， Wendt等(1993)开发了ITS ‑RFLP的技术， 利用多种限制性 内切酶酶切ITS序列， 能够准确的区分马铃薯腐烂茎线 虫和鳞球茎线 虫。 本发明申请人在前 期的研究(宛菲等， 2008)中发现， 马铃薯腐烂茎线 虫的ITS具有明显差异， 可以分为明显的2 种类型， A型和B型， 据此设计出2对特异性引物检测A型和B型， A型鳞球茎线虫特异引物为 DDS1/DDS2， 特异扩增片段为2 52bp； B型鳞球茎线虫特异引物为DDL1/DDL2， 特异扩增片段为 485bp； 引入线虫通用引物D3A/D3B作内标， 研究出一步双重PCR特异性检测鳞球茎线虫不同 类型群体的分子技术和方法， 该分子检测技术具有特异性强、 方法可靠、 灵敏性高、 操作简 便， 检测的精确度达到单条线虫的水平。 M arek等(2010)等根据D.destructor和D.dip saci 的差异开发出能够同时检测上述两种线虫的特异性引物DipU ‑F/DipU‑R， Des2‑F/Des1‑R， 其中DipU ‑F/DipU‑R能够特异的从D.dipsaci检测出333bp的片段， Des2 ‑F/Des1‑R能够特意 的从马铃薯腐烂茎线 虫中检测出453bp的片段。 刘斌等(2007)根据马铃薯腐烂茎线虫的ITS 序列设计了一组特异性引物， 能够 扩增出346b p的片段， 但是检测的样本只包括了腐烂茎线 虫。 Esquibet et al.(2003)和Zouhar et al.(2007)分别开发出鳞球茎线虫的SCAR ‑PCR检 测技术， 扩增的片段分别为242bp和325bp。 [0004]近些年， 在我国海关口岸连续从美国、 加拿大、 日本和西班牙等国家进口的大蒜、 洋水仙种球、 郁金香种球上截获过大量的鳞球茎线 虫， 但对于快速检测引物的开发， 国内暂 无报道。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种快速检测鳞球茎线虫的引 物、 试剂盒及应用， 以解决上 述现有技术存在的问题， 能特异 性检测鳞球茎线 虫， 为鳞球茎线 虫快速PCR早期诊断和辅助 鉴定等服务。 [0006]为实现上述目的， 本发明提供了如下 方案：说　明　书 1/6 页 3 CN 114410803 A 3