(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210112674.5 (22)申请日 2022.01.29 (71)申请人 龙岩学院 地址 364012 福建省龙岩市东肖北路1号 (72)发明人 刘建奎　魏春华　徐叶　戴爱玲　 杨小燕　 (74)专利代理 机构 福州君诚知识产权代理有限 公司 35211 代理人 戴雨君 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 鉴定类NADC-30毒株的实时荧光RT-PCR检测 引物和探 针组 (57)摘要 本发明公开了鉴定类NADC ‑30毒株的实时荧 光RT‑PCR检测引物和探针组， 包括两对引物和探 针， 分别为N1 ‑F、 N1‑R、 N1‑P、 N2‑F、 N2‑R、 N2‑P， 本 发明根据ORF 1b和ORF5基因片段分别设计两对特 异性引物和探针组， 通过优化确定最佳反应条 件， 并进行灵敏度、 特异性、 重复性实验以及临床 样品的检测， 建立了NADC30 ‑like PRRSV的双重 实时荧光定量PCR方法。 标准品在1 ×109copies/ μL~1×101copies/μL浓度范围内具有良好的 线性关系， 最低可检测到10copies/μL的标准品 阳性质粒， 使用本发明引物和探针的检测方法具 有灵敏度高、 特异性强、 稳定性好、 准确性高和检 测快速等优点， 可用于NADC30 ‑like PRRSV样品 的快速检测与定量分析。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 114292961 A 2022.04.08 CN 114292961 A 1.鉴定类NADC ‑30毒株的实时荧光RT ‑PCR检测引物和探针组， 其特征在于， 其包括两对 引物和探针， 序列如下： N1‑F： ACTTGCTTGTGCTGAG GATCAC； N1‑R： GATGACAG GCCACCCCTT； N1‑P： FAM‑TGCCATGATCTGT TGGTCACGCAG ‑BHQ1； N2‑F： AGAGTTGTGCTTGATGGTTCCG； N2‑R： ACGACCCCATTGTTCCGC； N2‑P： VIC‑CCGCAACCCCTGTAACCAAGATTT‑BHQ1。 2.根据权利 要求1所述的鉴定类NADC ‑30毒株的实时荧光RT ‑PCR检测引物和探针组， 其 特征在于， 用于扩增包 含荧光定量片段的PCR引物序列如下： N1‑PF： AGAAGAAAACCAGGACCATACT； N1‑PR： TTTTGAAGTAACTGAGCAC CAT； N2‑PF： GCAACCGTTTTAGCCTGTCTTT； N2‑PR： AGGGCATATATCATYACTG GCG。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114292961 A 2鉴定类NAD C‑30毒株的实时荧光RT ‑PCR检测引物和探针组 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 具体涉及鉴定类NADC ‑30毒株的实时荧光RT ‑PCR检测 引物和探针组。 背景技术 [0002]猪繁殖与呼吸综合征(Porcine  productive  and respiratory  syndrome， PRRS) 是由猪繁殖与呼吸综合征病毒( Porcine reproductive  and respiratory  syndrome， PRRSV)引起的一种高度接触性传染病。 现已遍布世界各地， 给全世界的养猪业造成了巨大 的经济损失。 PRRSV依据遗传 进化的差异可分为两个基因型， 分别是以LV毒株为代表的欧洲 型和以VR ‑2332毒株为代表的美洲型。 自1996年郭宝清等人首次从流产胎儿中分离出 PRRSV， 我国PRRSV流行以美洲 型为主， 呈现多种亚型并存的局面。 2013年， 周峰等人在我国 分离得到新的变异毒株， 经研究表明该变异毒株NSP2基因片段存在131(111+1+19)个氨基 酸的不连续缺失， 与美国2008年分离得到的NADC30毒株缺失模式相同， 命名为类NADC30株 (DANC30‑like)， 该类毒株已经成为我国的主要流行毒株。 NADC30 ‑like变异速率快， 且广泛 与我国存在的毒株进行重组， 使得我国PR RSV类型复杂多样， 增 加了PRRSV临床诊断的难度。 发明内容 [0003]本发明的目的在 于提供一种鉴定类NADC ‑30毒株的实 时荧光RT ‑PCR检测引物和探 针组。 [0004]为了实现上述目的， 本发明采用的技 术方案如下： [0005]鉴定类NADC ‑30毒株的实时荧光RT ‑PCR检测引物和探针组， 其包括两对引物和探 针， 序列如下： [0006]N1‑F： ACTTGCTTGTGCTGAG GATCAC； [0007]N1‑R： GATGACAG GCCACCCCTT； [0008]N1‑P： FAM‑TGCCATGATCTGT TGGTCACGCAG ‑BHQ1； [0009]N2‑F： AGAGTTGTGCTTGATGGTTCCG； [0010]N2‑R： ACGACCCCATTGTTCCGC； [0011]N2‑P： VIC‑CCGCAACCCCTGTAACCAAGATTT‑BHQ1。 [0012]进一步地， 本发明还提供了用于扩增包含荧光定量片段的PC R引物， 用于标准品的 制备， 具体如下： [0013]N1‑PF： AGAAGAAAACCAGGACCATACT； [0014]N1‑PR： TTTTGAAGTAACTGAGCAC CAT； [0015]N2‑PF： GCAACCGTTTTAGCCTGTCTTT； [0016]N2‑PR： AGGGCATATATCATYACTG GCG。 [0017]本发明根据NCBI已上传的我国流行的NADC30 ‑like序列， 根据ORF1b和ORF5片段， 设计了两对特异性引物和探针， 通过优化确定最佳反应条件， 并进行灵敏度、 特异性、 重复说　明　书 1/5 页 3 CN 114292961 A 3