(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210111742.6 (22)申请日 2022.01.29 (71)申请人 成都齐碳科技有限公司 地址 610041 四川省成 都市中国 （四川） 自 由贸易试验区成都高新区天府五街 200号7栋A区2 楼 (72)发明人 邹美娟　刘艺　 (74)专利代理 机构 北京东方亿 思知识产权代理 有限责任公司 1 1258 专利代理师 蒋桂梅 (51)Int.Cl. C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于表征靶多核苷酸测序 的接头、 构建体、 方法和应用 (57)摘要 本发明涉及用 于表征靶多核苷酸测序的接 头、 构建体、 方法和应用， 其中通过由核碱基为苯 并结构的核苷酸形成的阻滞带同时结合并停滞 多核苷酸结合蛋白。 本发明具有很多优势， 比如 简化接头的结构组成， 降低制备接头的难度和成 本等。 权利要求书2页 说明书18页 序列表6页 附图8页 CN 114457145 A 2022.05.10 CN 114457145 A 1.一种用于表征靶多核苷酸的接头， 所述接头包含阻滞带， 所述阻滞带用于同时结合 并停滞多 核苷酸结合蛋白。 2.根据权利要求1所述的接头， 其中所述接头还包含用于引导所述接头进入跨膜孔的 第一区段和用于连接靶多核苷酸的第二区段， 所述第一区段与所述第二区段之 间插入有 所 述阻滞带。 3.根据权利要求1或2所述的接头， 其中所述阻滞带包含由多个核苷酸连接形成的单链 核苷酸序列， 所述核苷酸的核碱基为苯并结构。 4.根据权利要求3所述的接头， 其中所述阻滞带用于结合并停滞 1个所述多核苷酸结合 蛋白； 优选地， 所述阻滞带为由7 ‑12个， 更优选8 ‑10个核苷酸连接形成的单链核苷酸序列。 5.根据权利要求3或4所述的接 头， 其中所述核苷酸选自以下一种或多种： 其中， n＝0或1 当n＝0时， X为N； Y为N、 C、 CCONH2或CCONHMe； R1为甲基或苯基； R2， R3和R4的其中一个或是 两个为硝基、 氟或是甲基； R5为任意基团； 当n＝1时， X和Y均为C； R3和R5中一个为甲基； R6为羰基； R1、 R2和R4为任意基团。 6.根据权利要求5所述的接头， 其中所述核苷酸的核碱基选自 以下一种或多种： 5 ‑硝基 吲哚、 4,6 ‑硝基吲哚、 2 ‑甲基‑4‑硝基吲哚、 2 ‑苯基‑4‑硝基吲哚、 5 ‑硝基吲哚 ‑3‑甲酰胺衍生 物、 3‑甲酰胺吲哚、 4 ‑甲基苯并咪唑、 4 ‑氟‑6‑甲基‑苯并咪唑、 2,4 ‑二氟甲苯、 4,6 ‑二氟‑1H‑ 苯并咪唑、 3 ‑甲基异喹诺酮和5 ‑甲基异喹诺。 7.根据权利要求1或2所述的接头， 其中所述接头不包含另外的用于结合所述多核苷酸 结合蛋白的区域； 优选地， 所述多核苷酸结合蛋白衍生自多核苷酸处理酶； 所述多核苷酸处理酶选自聚 合酶、 解旋酶 或核酸外切酶。 8.一种用于表征靶多核苷酸的构建体， 其中， 所述构建体包含靶多核苷酸和权利要求 1‑7中任一项所述的接 头， 其中所述接 头与所述靶多 核苷酸的任一端或两端连接 。 9.一种用于表征靶多核苷酸的复合物， 其中， 所述复合物包含多核苷酸结合蛋白， 和权 利要求1‑7中任一所述的接 头或权利要求8所述的构建体；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114457145 A 2其中， 所述多 核苷酸结合蛋白结合并停滞于所述阻滞带处； 优选地， 所述多核苷酸结合蛋白衍生自多核苷酸处理酶； 所述多核苷酸处理酶选自聚 合酶、 解旋酶 或核酸外切酶。 10.一种控制多 核苷酸结合蛋白在靶多 核苷酸上装载的方法， 所述方法包括： 提供具有靶多核苷酸的构建体， 其中所述靶多核苷酸在其一端或两端与接头连接， 所 述接头插入有阻滞带； 以及将所述构建体与所述多核苷酸结合蛋白接触， 使得所述多核苷 酸结合蛋白与所述阻滞带 结合， 并停滞于所述阻滞带处； 或 使多核苷酸结合蛋白装载到插入有阻滞带的接头上， 其中所述多核苷酸结合蛋白与 所 述阻滞带结合并停滞于所述阻滞带 处； 以及使 所述装载有靶多核苷酸结合蛋白的接头连接 到所述靶多 核苷酸。 11.根据权利要求10所述的方法， 其中所述接 头如权利要求1 ‑7中任一项所定义。 12.根据权利要求10或11所述的方法， 其中所述阻滞带结合并停滞 1个所述多核苷酸结 合蛋白； 优选地， 所述多核苷酸结合蛋白衍生自多核苷酸处理酶； 所述多核苷酸处理酶选自聚 合酶、 解旋酶 或核酸外切酶。 13.一种控制靶多 核苷酸穿过跨膜孔的移动的方法， 所述方法包括： (a)实施权利要求10 至12中任一项所述的方法； (b)将将步骤(a)中提供的装载有所述多核苷酸结合蛋白的靶多核苷酸与所述跨膜孔 接触； 以及 (c)跨所述跨膜孔施加电施， 使得所述多核苷酸结合蛋白移动穿过所述阻滞带， 并控制 所述靶多 核苷酸穿过所述跨膜孔的移动。 14.根据权利要求13所述的方法， 其中所述方法包括提供系链用于使所述构建体靠近 所述跨膜孔； 所述系链包括捕获区和锚定区， 所述捕获区用于捕获所述构建体的接头， 所述 锚定区用于与所述 跨膜孔或所述 跨膜孔所在的膜锚定结合。 15.一种表征靶多 核苷酸的方法， 所述方法包括： (a)实施权利要求13或14所述的方法； 以及 (b)随着所述靶多核苷酸相对于所述跨膜孔移动， 获取一个或多个测量值， 其中所述测 量值代表所述靶多 核苷酸的一个或多个特 征， 并由此表征 所述靶多 核苷酸。 16.根据权利要求15所述的方法， 其中所述跨膜孔是蛋白孔或固态孔； 和/或， 所述膜是 两亲层或固态层。 17.根据权利要求15所述的方法， 其中所述靶多核苷酸是完全双链多核苷酸、 部分双链 多核苷酸或单链多 核苷酸。 18.一种用于控制靶多 核苷酸移动的试剂盒， 所述试剂盒包括： (a)权利要求1至7中任一项所述的接 头， (b)多 核苷酸结合蛋白， 和/或(c)跨膜孔蛋白。 19.根据权利要求1至7中任一项所述的接头、 权利要求8所述的构建体、 权利要求9所述 的复合物、 权利要求 10‑17中任一项所述方法、 或权利要求 18所述的试剂盒在制备用于表征 靶多核苷酸的产品或在表征靶多 核苷酸中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114457145 A 3