(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210112981.3 (22)申请日 2022.01.29 (71)申请人 宁波熙宁 检测技术有限公司 地址 315000 浙江省宁波市高新区 聚贤路 587弄15号5#楼028幢4-1 申请人 上海精翰生物科技有限公司 (72)发明人 黄启宽　彭祥翔　章恒　 (74)专利代理 机构 南通鼎点知识产权代理事务 所(普通合伙) 32442 代理人 朱建 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 同时检测VSVG和ALB基因的多重qPCR反应体 系的建立方法 (57)摘要 本发明公开了一种同时检测VSVG和ALB基因 的多重qPCR反应体系的建立方法， 建立qPCR反应 体系， 其配制如下， 在20μL反应体系中， 加入 TaqMan Fast Advanced  Master Mix、 VSVG引物 及探针、 ALB引物及探针、 1μL  DNA模板， 用去离 子水补足至20μL。 本发明所提的一种同时检测 VSVG和ALB基因的多重qPCR反应体系的建立方 法， 能够在同一反应孔中进行2 个基因的扩增， 可 以使用更少的样品体积， 减少反应孔间的差异， 减少加样误差， 节省试剂， 节约经费开支。 权利要求书2页 说明书5页 附图5页 CN 114369687 A 2022.04.19 CN 114369687 A 1.一种同时检测VSVG和ALB基因的多重qPCR反应体系的建立方法， 其特征在于， 建立 qPCR反应体系， 其配制如下， 在2 0 μL反应体系中， 加入TaqMan  Fast Advanced  Master Mix、 VSVG引物及探针、 ALB引物及探针、 1 μL  DNA模板， 用去离 子水补足至20 μL。 2.根据权利要求1所述的一种同时检测VSVG和ALB基因的多重qPCR反应体系的建立方 法， 其特征在于， 所述TaqMan  Fast Advanced Master Mix的型号 为ABI， 4444556。 3.根据权利要求1所述的一种同时检测VSVG和ALB基因的多重qPCR反应体系的建立方 法， 其特征在于， 所述VSVG引物包括VSVG正向引物和VSVG反向引物， VSVG正向引物和VSVG反 向引物的的终浓度为320nM； 所述ALB引物包括ALB正向引物和ALB反向引物， 所述ALB正向引 物和ALB反向引物的终浓度为10 0nM。 4.根据权利要求3所述的一种同时检测VSVG和ALB基因的多重qPCR反应体系的建立方 法， 其特征在于， 合 成所述VSVG和所述ALB正向引物、 反向引物和探针的溶液的制备见表1和 表2： 表1.VSVA基因的引物探针序列 名称 VSVG VSVG正向引物 TGCAAGGAAAGCATTGAACAA VSVG反向引物 GAGGAGTCACCTGGACAATCACT VSVG探针 AGGAACTTGGCTGAATCCAGGCTTCC 报告基团 FAM 淬灭基团 MGB 表2.内参基因ALB的引物探针序列 名称 ALB ALB正向引物 TGAAACATACGT TCCCAAAGAGTTT ALB反向引物 CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT ALB探针 TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA 报告基团 VIC 淬灭基团 MGB VSVG探针的5 ’端和3’端分别用FAM荧光基团和MGB淬灭灭基团进行修饰， 获得的VSVG特 异探针为： FAM ‑AGGAACTTGGCTGAATCCAGGCTTCC‑MGB； 内参基因ALB探针的5 ’端和3’端分别用VIC荧光基团和MGB淬灭基团进行修饰， 获得的 ALB特异探针为： VIC ‑TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA ‑MGB。 5.根据权利要求4所述的一种同时检测VSVG和ALB基因的多重qPCR反应体系的建立方 法， 其特征在于， 在qPCR反应体系中， 将VSVG基因和内参基因ALB在同一反应孔中进行反应， 分别在鱼精DNA和人基因 组DNA稀释的标准曲线中进行反应。 6.根据权利要求5所述的一种同时检测VSVG和ALB基因的多重qPCR反应体系的建立方 法， 其特征在于， 鱼精DNA工作液的制备方法如下： 将鱼精DNA储存液(5mg/mL)从 ‑20℃冰箱 取出并融解， 取10μL加入1990μL  TE缓冲液中， 振荡混匀， 形成25ng/μL鱼精DNA工作液， 并 于‑20℃保存。 7.根据权利要求5所述的一种同时检测VSVG和ALB基因的多重qPCR反应体系的建立方 法， 其特征在于， 人基因组DNA工作液的制备方法如下： 根据人基因组DNA产品说明书 标识的权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114369687 A 2浓度， 用TE缓冲液将人基因 组DNA稀释成25ng/ μL人基因 组DNA工作液， 并于 ‑20℃保存。 8.根据权利要求5所述的一种同时检测VSVG和ALB基因的多重qPCR反应体系的建立方 法， 其特征在于， 合成VSVG和ALB基因片段， 将此基因片段连接至质粒Puc57， 获得重组质粒 Puc57‑VSVG‑ALB， 分别使用25ng/ μL鱼精DNA工作 液和25ng/ μL鱼精DNA工作液将其稀释至1 ×10^6copies/μL， 1 ×10^5copies/μL， 1 ×10^4copies/μL， 1 ×10^3copies/μL， 1 ×10^ 2copies/ μL， 10 copies/ μL。 9.根据权利要求1 ‑8任一项所述的一种同时检测VSVG和ALB基因的多重qPCR反应体系 的建立方法， 建立 一种多重qPCR反应 体系， 在此反应 体系中2个 基因扩增相互间没有干扰。 10.根据权利要求9所述的一种多重qPCR反应 体系， 可同时检测VSVG基因和ALB基因。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114369687 A 3