(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210112677.9 (22)申请日 2022.01.29 (71)申请人 龙岩学院 地址 364012 福建省龙岩市东肖北路1号 (72)发明人 徐叶　刘建奎　赖丽玲　魏春华　 戴爱玲　 (74)专利代理 机构 福州君诚知识产权代理有限 公司 35211 代理人 戴雨君 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 同时鉴别四类毒株的荧光定量检测引物和 探针组 (57)摘要 本发明公开了同时鉴别四类毒株的荧光定 量检测引物和探针组， 包括四对引物和探针， 分 别为A‑F、 A‑R、 A‑P、 H‑F、 H‑R、 H‑P、 V‑F、 V‑R、 V‑P、 G‑F、 G‑R、 G‑P。 本发明提供了鉴别PRRSV通用型、 HP‑PRRSV毒株、 类QYYZ毒株和经典毒株的荧光定 量检测引物和探针组,能够同时区分HP ‑PRRSV、 NADC30‑like PRRSV、 VR2332 ‑like PRRSV和 QYYZ‑like PRRSV的引物和探针组， 为PRRSV的早 期快速检测、 流行病学调查， 以及预防和控制中 国PRRS的流行提供快速、 简便和可靠的技术工 具。 使用本发明引物和探针的检测方法， 具有灵 敏度高、 特异性强、 稳定性好、 准确性高和检测快 速等优点， 可用于PRRSV样品的快速检测与鉴别 诊断。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 114410843 A 2022.04.29 CN 114410843 A 1.同时鉴别PRRSV通用型、 HP ‑PRRSV毒株、 类QYYZ毒株和经典毒株的荧光定量检测引物 和探针组， 其特 征在于， 鉴定PRRSV通用型检测的引物和探针序列如下： A‑F： CCGCRSGST TTCATCCGA； A‑R： ARTGYGC CGTTRACYGTAG； A‑P： FAM‑AACCACGCATTTGTCGTCCGGC‑BHQ1； 鉴定HP‑PRRSV毒株的引物和探针序列如下： H‑F： GCACCGCGWAGRACTGTRAC； H‑R： GGGRAAGCCTYATATTCCGTYT； H‑P： VIC‑ACGCTGACGCAC CAGGATGAGCC‑BHQ1； 鉴定经典PR RSV毒株的引物和探针序列如下： V‑F： CAGTTGGGAAGATTTGGCTGTT； V‑R： GACACA ATCACCAGCTCACT T； V‑P： ROX‑AGTAGCCCCTTTGATCTCCCGACC‑BHQ2； 鉴定类QY YZ毒株的引物和探针序列如下： G‑F： TGAGTC CCCCGGCATAGG； G‑R： AGGGCTGCTCATCTCT TTTARC； G‑P： CY5‑CGGCTTGGTGTCAGATC CTGGGGT‑BHQ2。 2.根据权利要求1所述的同时鉴别PRRSV通用型、 HP ‑PRRSV毒株、 类QYYZ毒株和经典毒 株的荧光定量检测引物和探针组， 其特征在于， 用于扩增包含荧光定量片段的P CR引物序列 如下： A‑PF： ACGCCARTRATGATATATGC； A‑PR： CAATCAGTGC CAYTCACCA； N‑PF： CTYYTTTGAYTGGRATGTTGTG； N‑PR： CGAGWATCATYT TYGGGAGRRA； G‑PF： GGGAAACAGGAAACACCGTTG； G‑PR： AGAAGAAAACAGGGAGATGGGA； 判定标准： 当FAM通道和VIC通道CT值同时小于40且CY5通道、 ROX通道CT值为None时， 结果判定为 HP‑PRRSV； 当FAM通道和ROX通道CT值同时小于40且VIC通道、 CY5通道道CT 值为None时， 结果 判定为VR2 332‑like毒株； 当FA M通道和CY5通道CT值同时小于40且VIC通道、 ROX通道CT值为 None时， 结果判定为QYYZ ‑like毒株； 当FAM通道CT值小于40且VIC通道、 CY5通道、 ROX通道CT 值为None时， 结果判定为 NADC30‑like毒株。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410843 A 2同时鉴别四类毒株的荧光定量 检测引物和探针组 技术领域 [0001]本发明涉及 生物技术领域， 具体涉及同时鉴别四类毒株的荧光定量检测引物和探 针组， 即同时鉴别PRRSV通用型、 HP ‑PRRSV毒株、 类QYYZ毒株和经典毒株的荧光定量检测引 物和探针组,能够同时区分HP ‑PRRSV、 NADC30 ‑like PRRSV、 QYYZ ‑like PRRSV和VR2332 ‑ like PRRSV。 背景技术 [0002]猪繁殖与呼吸综合征(Porcine  productive  and respiratory  syndrome， PRRS) 是由猪繁殖与呼吸综合征病毒( Porcine reproductive  and respiratory  syndrome， PRRSV)引起的一种高度接触性传染病。 现已遍布世界各地， 给全世界的养猪业造成了巨大 的经济损失。 PRRSV依据遗传 进化的差异可分为两个基因型， 分别是以LV毒株为代表的欧洲 型和以VR ‑2332毒株为代表的美洲型。 自1996年郭宝清等人首次从流产胎儿中分离出 PRRSV， 我国一直流行的毒株是CH ‑1a。 2006年中国爆 发了由HP ‑PRRSV引起的HP ‑PRRS， 该类 毒株在Nsp2基因存在30(1+29)个氨基酸的不连续缺失， 该类毒株很快成为我国主要流行毒 株。 2013年， 周峰等人在我国分离得到新的变异毒株， 经研究表明该变异毒株Nsp2基因片段 存在131(111+1+19)个氨基酸的不连续缺失， 与美国2008年分离得到的NADC30毒株缺失模 式相同， 命名为类NADC30株(DANC30 ‑like)， 该类毒株目前已经取代HP ‑PRRSV成为我国的主 要流行毒株。 2011年， 我国报道出现Lineage  3PRRSV， 这类病毒在Nsp2 基因中存在36个氨基 酸的连续插 入， 该类毒株主 要流行于我国的华 南地区。 发明内容 [0003]本发明的目的在于提供同时鉴别四类毒株的荧光定量检测引物和探针 组， 即同时 鉴别PRRSV通用型、 HP ‑PRRSV毒株、 类QYYZ毒株和经典毒株的荧光定量检测引物和探针组， 能够同时区分HP ‑PRRSV、 NADC 30‑like PRRSV、 QYYZ‑like PRRSV和VR23 32‑like PRRSV。 [0004]为了实现上述目的， 本发明采用的技 术方案如下： [0005]鉴别PRRSV通用型、 HP ‑PRRSV毒株、 类QYYZ毒株和经典PRRSV毒株的荧光定量检测 引物和探针组， 具体如下： [0006]鉴定PRRSV通用性的引物和探针序列如下： [0007]A‑F： CCGCRSGST TTCATCCGA； [0008]A‑R： ARTGYGC CGTTRACYGTAG； [0009]A‑P： FAM‑AACCACGCATTTGTCGTCCGGC‑BHQ1； [0010]鉴定HP‑PRRSV毒株的引物和探针序列如下： [0011]H‑F： GCACCGCGWAGRACTGTRAC； [0012]H‑R： GGGRAAGCCTYATATTCCGTYT； [0013]H‑P： VIC‑ACGCTGACGCAC CAGGATGAGCC‑BHQ1； [0014]鉴定经典PR RSV毒株的引物和探针序列如下：说　明　书 1/7 页 3 CN 114410843 A 3