(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210113090.X (22)申请日 2022.01.29 (71)申请人 宁波熙宁 检测技术有限公司 地址 315000 浙江省宁波市高新区 聚贤路 587弄15号5#楼028幢4-1 申请人 上海精翰生物科技有限公司 (72)发明人 黄启宽　彭祥翔　章恒　 (74)专利代理 机构 南通鼎点知识产权代理事务 所(普通合伙) 32442 代理人 朱建 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 多重qPCR检测 GALV和ALB拷贝数判定CAR-T 细胞产品中RCR阴 阳性的方法 (57)摘要 本发明公开了一种多重qPCR检测GALV和ALB 拷贝数判定CAR ‑T细胞产品中RCR阴阳性的方法， 其特征在于， 包括如下步骤： 全血样品抽取DNA， 通过合成含有目的基因和内参基因的质粒， 用于 配制标准曲线和质控样品， 并建立多重qPCR反应 体系来检测样品中的RCR。 特异性强： 针对目的基 因设计了特异性探针， 在特异性评估中验证通 过。 灵敏度高： 反应更灵敏， 方法的检测下限能够 达到10copies/μL。 省时省力： qPCR检测RCR的方 法操作简单， 更易入手， 反应时间只需1小时。 权利要求书2页 说明书6页 CN 114410844 A 2022.04.29 CN 114410844 A 1.一种多重qPCR检测GALV和ALB拷贝数判定CAR ‑T细胞产品中RCR阴阳性的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 全 血样品抽取DNA， 通过合 成含有目的基因和内参基因的质粒， 用于 配制标准曲线和质控样品， 并建立多重qPCR反应 体系来检测样品中的RCR。 2.根据权利要求1所述的一种多重qPCR检测GALV和ALB拷贝数判定CAR ‑T细胞产品中 RCR阴阳性的方法， 其特征在于， 所述qPCR反应体系的配制如下， 在20μL反应体系中， 加入 TaqMan Fast Advanced Master Mix、 GALV引物及探针、 ALB引物及探针、 1 μL  DNA模板， 用去 离子水补足至20 μL。 3.根据权利要求2所述的一种多重qPCR检测GALV和ALB拷贝数判定CAR ‑T细胞产品中 RCR阴阳性的方法， 其特征在于， 所述TaqMan  Fast Advanced  Master Mix的型号为ABI， 4444556。 4.根据权利要求2所述的一种多重qPCR检测GALV和ALB拷贝数判定CAR ‑T细胞产品中 RCR阴阳性的方法， 其特征在于， 所述GALV引物包括GALV正向引物和GALV反向引物， GALV正 向引物和GALV反向引物 的的终浓度为320nM； 所述ALB引物包括ALB正向引物和ALB反向引 物， 所述ALB正向引物和ALB反向引物的终浓度为120nM 。 5.根据权利要求4所述的一种多重qPCR检测GALV和ALB拷贝数判定CAR ‑T细胞产品中 RCR阴阳性的方法， 其特征在于， 合 成所述GALV和所述A LB正向引物、 反向引物和探针的溶液 的制备见表1和表 2： 表1.GALV基因的引物探针序列 名称 GALV GALV正向引物 GAGTCCTGGGAGCTGGAAAAG GALV反向引物 GGCTGGTGGGGGTTCTTATTT GALV探针 AAGCTGCGTAT TCGGCGGCGGCG 报告基团 FAM 淬灭基团 BHQ 表2.内参基因ALB的引物探针序列 名称 ALB ALB正向引物 TGAAACATACGT TCCCAAAGAGTTT ALB反向引物 CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT ALB探针 TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA 报告基团 VIC 淬灭基团 MGB GALV探针的5 ’端和3’端分别用FAM荧光基团和MGB淬灭灭基团进行修饰， 获得的GALV特 异探针为： FAM ‑AAGCTGCGTAT TCGGCGGCGGCG‑MGB； 内参基因ALB探针的5 ’端和3’端分别用VIC荧光基团和MGB淬灭基团进行修饰， 获得的 ALB特异探针为： VIC ‑TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA ‑MGB。 6.根据权利要求1所述的一种多重qPCR检测GALV和ALB拷贝数判定CAR ‑T细胞产品中 RCR阴阳性的方法， 其特征在于， 所述质粒标准品的制备， 在GA LV和ALB基因片段连接至质粒 Puc57， 获得重组质粒Puc 57‑GALV‑ALB。 7.根据权利要求6所述的一种多重qPCR检测GALV和ALB拷贝数判定CAR ‑T细胞产品中权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114410844 A 2RCR阴阳性的方法， 其特征在于， 所述标曲曲线和质控样品的配制： 使用鱼精DNA将质粒 Puc57‑GALV‑ALB稀释成1 ×106copies/μL、 1 ×105copies/μL、 1 ×104copies/μL、 1 × 103copies/μL、 100copies/μL、 50copies/μL、 10copies/μL， 质控样品分别为ULOQ(1 × 106copies/μL)、 HQC(50000copies/μL)、 MQC(5000copies/μL)、 LQC(500copies/μL)、 LLOQ (10copies/ μL)。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114410844 A 3