(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210118460.9 (22)申请日 2022.02.08 (71)申请人 安徽科技学院 地址 233100 安徽省滁州市凤阳东 华路9号 (72)发明人 李文超　刘欣超　顾有方　顾月月　 陈东前　李乔乔　罗昕雨　 (74)专利代理 机构 西安铭泽知识产权代理事务 所(普通合伙) 61223 代理人 崔瑞迎 (51)Int.Cl. C12Q 1/6893(2018.01) C12Q 1/6848(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种能同时检测牛人五毛滴虫和巴特里四 毛滴虫的双重套式PCR方法及应用 (57)摘要 本发明属于分子检测技术领域， 涉及一种能 同时检测牛人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫的双 重套式PCR方法及应用， 以人五毛滴虫和巴特里 四毛滴虫阳性对照混合物为模板， 以毛滴虫属特 异性引物为扩增引物进行扩增， 以第一轮PCR获 得的扩增产物 为模板， 以人五毛滴虫种特异性引 物和巴特里四毛滴虫种特异性引物的混合物为 引物进行扩增， 用于同时检测人五毛滴虫和巴特 里四毛滴虫。 本发明的方法能特异性地扩增人五 毛滴虫和巴特里四毛滴虫目的片段， 最低能检查 到500fg/μL的阳性对照DNA。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图3页 CN 114196771 A 2022.03.18 CN 114196771 A 1.一种能同时检测牛人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫的双重套式PCR方法， 其特征在于， 具体包括如下步骤： S1， 第一轮PCR： 以人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫阳性对照混合物为模板， 以毛滴虫属 特异性引物为扩增引物进行扩增； S2， 第二轮PCR： 以S1中获得的扩增产物为模板， 以人五毛滴虫种特异性引物和巴特里 四毛滴虫种特异性引物的混合物为引物进行扩增； 扩增获得大小分别为339bp和623bp的两条目的片段， 即同时检测到人五毛滴虫和巴特 里四毛滴虫两种虫种。 2.根据权利要求1所述的能同时检测牛人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫的双重套式PCR 方法， 其特征在于， S1中， 所述毛滴虫属特异性引物的上游引物F的序列如SEQ  ID No.1所 示， 下游引物R的序列如SEQ  ID No.2所示。 3.根据权利要求1所述的能同时检测牛人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫的双重套式PCR 方法， 其特征在于， S2中， 所述巴特里四毛滴虫种特异性引物包括序列如SEQ  ID No.3所示 的上游引物TF和序列如SEQ  ID No.4所示的下游引物TR。 4.根据权利要求1所述的能同时检测牛人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫的双重套式PCR 方法， 其特征在于， S2中， 所述人五毛滴虫种特异性引物包括序列如SEQ  ID No.5所示的上 游引物PF和序列如SEQ  ID No.6所示的下游引物PR。 5.根据权利要求1所述的能同时检测牛人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫的双重套式PCR 方法， 其特征在于， S 1中， PCR反应条件为： 95℃10min， 然后， 95℃60s， 60℃60s， 72℃60s， 共 30个循环， 最后72℃延伸7mi n。 6.根据权利要求1所述的能同时检测牛人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫的双重套式PCR 方法， 其特征在于， S2中， PCR反应条件为： 95℃10min， 然后， 95℃60s， 58℃60s， 72℃60s， 共 30个循环， 最后72℃延伸7mi n。 7.根据权利要求1所述的能同时检测牛人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫的双重套式PCR 方法， 其特 征在于， S2中， 所述的3 39bp大小的目的片段为人五毛滴虫DNA。 8.根据权利要求1所述的能同时检测牛人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫的双重套式PCR 方法， 其特 征在于， S2中， 所述的623bp大小的目的片段为巴特 里四毛滴虫DNA。 9.一种权利要求1 ‑8任一项所述的能同时检测牛人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫的双重 套式PCR方法在牛养殖中的应用。 10.根据权利要求9所述应用， 其特征在于， 所述的双重套式PCR方法用于同时检测牛粪 便中的人五毛滴虫和巴特 里四毛滴虫。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114196771 A 2一种能同时检测牛人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫的双重套式 PCR方法及应用 技术领域 [0001]本发明属于分子检测技术领域， 涉及一种能同时检测牛人五毛滴虫和巴特里四毛 滴虫的双重套式PCR方法及应用。 背景技术 [0002]毛滴虫是寄生于脊椎动物的消化系统和泌尿生殖道的原生动物， 是最古老的真核 生物， 既包括致病性的物种也包括一些共生的物种。 毛滴虫也是牛体内非常常见的原虫， 目 前已报道的牛毛滴虫虫种主要有胎儿三毛 滴虫(Tritrichomonas  foetus,T.foetus)， 以及 一些寄生于牛肠道的毛滴虫虫种， 如人五毛滴虫(Pentatrichomonas  hominis, P.hominis)， 巴特里四毛滴虫(Tetratricho monas buttreyi,T.buttreyi)等。 其中， 胎儿三 毛滴虫是最常见 的牛毛滴虫， 寄生于母牛和公牛生殖器官内， 可引起牛 的一种经性传播的 原虫病， 即牛毛滴虫病， 该病可导致牛早产、 死胎， 进而给养牛业造成重大的经济损失， 该病 已被OIE列入世界动物卫生组织疫病名录， 我国将其列为三类动物疫病。 人五毛滴虫， 可在 人、 犬、 猫、 非人灵长类及啮齿类动物的大肠内繁殖， 经粪便排出体外， 滋养体可在宿 主间直 接传染， 过去通常认为其和宿主是一种共生关系， 然而一些报道认为人五毛滴虫是导致人 或动物宿主出现腹泻的原因之一， 其潜在的人畜共患的风险仍有待进一步的确定。 巴特里 四毛滴虫是一种广泛寄生于猪肠道的共生毛滴虫， 尤其是低龄和高龄猪群感染率较高。 近 年来研究发现， 该 虫种也可广泛寄生于牛的肠道。 [0003]临床上牛感染毛滴虫多为隐性感染， 即使有临床症状， 症状往往也不典型， 因此牛 毛滴虫病的诊断难度较大， 确诊必须借助于实验室检测。 目前常规的检测毛滴虫 的方法主 要有光镜检查法、 培养法和分子检测法。 但不同虫种的毛滴虫形态相似， 用光镜检查法或培 养后镜检， 在光镜下无法精确区分不同的毛滴虫虫种。 因排便或牛与公牛间偶尔的身体接 触， 肠道毛滴虫如人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫等可能污染牛的生殖道， 并可在生殖道内 短期存活， 当用镜检法或培养法检查时， 易造成假阳性结果， 进而高估胎儿三毛滴虫在牛群 中的流行。 此外， 光镜检查法和培养法， 要求所用的样本如粪便或牛生殖道冲洗物， 必须是 新鲜的， 存在由于冷藏或没有及时处理样品致虫体死亡导致假阴性的出现等弊端。 目前， 已 发展了一些检测胎儿三毛滴虫的分子方法， 但检测人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫的分子方 法的报道较少。 发明内容 [0004]本发明所要解决的技术问题在于针对现有技术的不足， 提供了一种能同时检测牛 人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫的双重套式PCR方法及应用， 通过两轮套式PCR， 特异性地扩 增人五毛滴虫和巴特里四毛滴虫目的片段， 与胎儿三毛滴虫、 微小隐孢子虫、 贾第虫、 芽囊 原虫、 毕氏肠微孢子虫、 牛艾美耳球虫和邱氏艾美耳球虫等来自于牛 的多种原虫 的基因组 DNA无交叉反应； 最低能检查到 500fg/ μL的阳性对照DNA。说　明　书 1/7 页 3 CN 114196771 A 3