(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210118685.4 (22)申请日 2022.02.08 (71)申请人 山东见微生物科技有限公司 地址 250000 山东省济南市高新区大正路 1777号生物医药园中小企业产业化基 地5号楼101厂房和6号楼10 5厂房 (72)发明人 曹玉峰　郑冉　高青　 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测EBV和HCMV病毒的引物探针组合物及其 应用 (57)摘要 本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及同 时检测EBV病毒和人巨细胞病毒HCMV的引物探针 组合物及其应用。 本发明所述的引物组合物互不 发生干扰， 具有较好的检测灵敏度和准确度， 且 操作简便， 能够广泛应用于EBV病毒和人巨细胞 病毒HCMV的临床诊断。 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图2页 CN 114350858 A 2022.04.15 CN 114350858 A 1.一种检测EBV和HCMV病毒的引物探针组合物， 其特征在于： 所述的引物探针组合物包 括HCMV检测引物探针组合物、 EBV检测引物探针组合物和内标检测引物探针组合物； (1)HCMV检测引物探针组合物： 正向引物H CMVF： 5’ ‑TCAGCATGTGCTC CTTGATTCT‑3’ 反向引物H CMVR： 5’ ‑GTGTTGTTATCCTCCTCTACAGTCA AAC‑3’ 探针HCMVP： 5’ ‑TGCCGCACCATGTCCACTCGAA‑3’； (2)EBV检测引物探针组合物： 正向引物EBF： 5 ’ ‑AAGTGGTCCTGCAGCTAT TTCTG‑3’ 反向引物EBR： 5 ’ ‑AGAAGACCCCCTCTTACATTTGTG‑3’ 探针EBP： 5 ’ ‑CGCATCAGAGCGC CAGGAGTCC‑3’； (3)内标检测引物探针组合物： 正向引物ICF： 5 ’ ‑AGATTTGGACCTGCGAGCG ‑3’ 反向引物ICR： 5 ’ ‑GAGCGGCTGTCTC CACAAGT‑3’ 探针ICP： 5 ’ ‑TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG ‑3’。 2.根据权利要求1所述的引物探针组合物， 其特征在于： 所述的HCMV检测引物探针组合 物用于检测SEQ  ID NO.1所示的序列， 所述的EBV检测引物探针组合物用于检测SEQ  ID  NO.5所示的序列， 所述的内标检测引物探针组合物用于检测SEQ  ID NO.9所示的序列。 3.根据权利要求2所述的引物探针组合物， 其特征在于： 所述的探针的5 ’端荧光标记选 自FAM基团、 VIC/HEX/JOE基团、 ROX基团、 CY5基团、 CY3基团、 TAMRA基团其中不同的三种； 淬 灭基团选自BHQ ‑1、 BHQ‑2或BHQ‑3中的一种或多种。 4.根据权利要求3所述的引物探针组合物， 其特征在于： 所述的探针HCMVP使用FAM ‑ BHQ‑1标记； 所述的探针EBP使用VIC ‑BHQ‑1标记； 所述的探针ICP使用C Y5‑BHQ‑2标记。 5.权利要求1 ‑4任一项所述的引物探针组合物在制备检测EBV和HCMV病毒产品中的应 用。 6.一种检测EBV和HCMV病毒的产品， 其特征在于： 所述的产品包括权利要求1 ‑4任一项 所述的引物探针组合物。 7.根据权利要求6所述的产品， 其特征在于： 所述的产品还包括PCR反应液， 质控品： 阴 性对照、 EBV阳性对照、 H CMV阳性对照、 内标， 和快速核酸释放剂。 8.根据权利要求7所述的产品， 其特征在于： 所述的PCR反应液包括50mM三羟甲基氨基 甲烷(pH6.8)、 75mM醋酸钾、 3.0mM醋酸镁、 0.05mM  EDTA二钠、 5U热启动Taq  DNA聚合酶、 0.2U 不耐热UNG酶、 0.2mM  dNTPs、 0.1 ％BSA、 0.02％Proclin300、 各0.2 μM的引物、 各0.1 μM荧光探 针。 9.根据权利要求8所述的产品， 其特征在于： 所述的阴性对照为EBV和HCMV  DNA为阴性 的血清； 所述的HCMV阳性对照为含HCMV靶序列 SEQ ID NO.1的DNA假病毒； 所述的EBV阳性对 照为含EBV靶序列SEQ  ID NO.5的DNA假病毒； 所述的内标为含有人RNaseP基因片段SEQ  ID  NO.9的克隆质粒。 10.根据权利 要求9所述的产品， 其特征在于： 所述的快速核酸释放剂含有100 ‑200mM的 KOH或NaOH、 1 ‑5％的CA ‑630或NP ‑40或Twen ‑20， 5‑10％的LLS或SDS以及100 ‑200μM的 Surfacti n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350858 A 2检测EBV和HCMV病毒 的引物探针组合物及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一种同时检测EBV病毒和人巨细胞病毒 HCMV的引物探针组合物及其应用。 背景技术 [0002]EB病毒和人巨细胞病毒同属人类疱疹病毒， 其中EB病毒(Epstein ‑Barr Virus， EBV)为人类疱疹病毒属的γ亚科， 又名人疱疹病毒4型； 人巨细胞病毒(Human   Cytomegalovirus， HCMV)为人类疱疹病毒属的β 亚科疱疹病毒， 又名人疱疹病毒5型。 EBV与 HCMV均为双链DNA病毒。 目前已经发现 的疱疹病毒有100种以上， 其中与人类感染有关 的疱 疹病毒至少有8种， 包括： HSV ‑1、 HSV‑2、 水痘一带状疱疹病毒(VZV)、 EB V、 巨细胞病毒(HCMV) 和HHV‑6、 HHV‑7、 HHV‑8。 [0003]8种人类疱疹病毒除具有典型的疱疹病毒形态特征外， 最重要的生物学特性是原 发感染后病毒在体内持续存在， 因此疱疹病毒感染者体内病毒易被周期性激活， 病毒激活 后仍具有传染性。 因此， 疱疹病毒感染者随时都可分泌一种或多种 疱疹病毒， 使得普通人群 保持较高的感染率。 其中以EBV和HCMV病毒危害最大， 已知EBV与非洲Burkitt ’s淋巴瘤、 鼻 咽癌和移植后淋巴增生 性疾病有关。 而H CMV会导致孕妇感染后的胎儿先天畸形甚至死胎。 [0004]EBV和HCMV感染较为普遍， 大多数人在少儿期感染过EB和HCMV， 多呈无临床症状的 急性感染或潜伏感染， 同时因感染而获得免疫。 在特殊情况下， 比如自身免疫缺陷、 获得性 免疫权限、 服用免疫抑制药物 等， EB和HCMV病毒会容易活化 感染。 大多 数HCMV感染临床表现 与EBV感染相同， 这2种病毒 是持续发热性疾病的重要病原。 在临床 检测中， 有时仅根据临床 表现无法分辨EBV和HCMV感染， 需要同时检测EBV和HCMV， 此外， 也会对 艾滋病患者和器官移 植患者进行EBV和H CMV的筛查。 [0005]EBV和HCMV感染的诊断包括血清 学检查、 病毒标志物检查、 病毒 分离。 目前， 血清 学 标志物检测通常作为急性或慢性EBV、 HCMV感染的辅助诊断方法， 抗VCA ‑IgM、 HCMV ‑IgM/IgG 检测是急性原发感染的重要指标。 但血清学标志物实际上是检测人体对感染的免疫反应状 态， 无法检测病毒本身， 也就无法准确灵敏的反映感染的情况。 此外， 随着技术的发展， 定量 检测病毒也逐渐成为可能。 例如专利CN201410026784.5公开了一种同时检测常见人疱疹病 毒HSV‑1、 HSV‑2、 EBV和HCMV的实时荧光定量PCR试剂盒， 由定量PCR反应液、 定量反应液、 HSV‑1标准品、 HSV ‑2标准品、 EB V标准品、 HCMV标准品、 阴性对照品、 HSV ‑1阳性对照品、 HSV ‑2 阳性对照品、 EBV阳性对照品、 HCMV阳性对照品、 说明书和盒体组成， 可对样品中的四种人疱 疹病毒同时进行分型检测， 满足早期、 快速、 准确诊断的需要， 为流行病 学调查和及时制 定 针对性治疗 方案提供有力依据。 专利CN201710118846.9则公开了一种人疱疹病毒各亚型快 速检测试剂， 包括特异性扩增HSV ‑1RL2， HSV ‑2UL28， VZV  ORF26， EBV  EBNA1， HCMV IE， HHV‑ 6A或HHV‑6B U22， HHV‑6A或HHV‑6B IE， HHV‑7U95和KSHV ORF72的正反向引物和相应内参标 品， 可针对不同来源的感染早期临床样本进 行快速、 有效的各亚型鉴别与诊断， 具有很高的 临床诊断使用价 值。说　明　书 1/6 页 3 CN 114350858 A 3