(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210118422.3 (22)申请日 2022.02.08 (71)申请人 上海市第一人民医院 地址 200080 上海市虹口区武进路85号 (72)发明人 孙晓东　万晓玲　王鑫杰　陈洁琼　 吴轶栋　 (74)专利代理 机构 北京中政联科专利代理事务 所(普通合伙) 11489 专利代理师 陈超 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) (54)发明名称 检测LHON致病突变的CRISPR-Cas 组合物、 试 剂盒和方法 (57)摘要 本发明提供一种检测LHON致病突变的 CRISPR‑Cas组合物、 试剂盒和方法， 涉及基因检 测技术领域。 本发明提供的CRISPR ‑Cas组合物和 试剂盒包括Cas12a蛋白和SEQ  ID NO.1/11/17所 示的crRNA， 其可用于精准地检测样品的LHON的 三个原发突变位点(m.3460G>A、 m.11778G>A和 m.14484T>C)， 具有检测快速、 简便易操作、 特异 性和灵敏度高、 可视化， 无需大型仪器和昂贵试 剂等特点， 为LHON快速诊断提供了分子基础， 而 且适用于在人群中大规模筛查突变携带者， 为其 遗传咨询和产前诊断提供帮助。 权利要求书2页 说明书11页 序列表9页 附图10页 CN 114774530 A 2022.07.22 CN 114774530 A 1.检测LHON致病突变的CRISPR ‑Cas组合物， 其特征在于， 所述LHON致病突变选择如下 突变中的至少一种： m.11778G>A、 m.346 0G>A、 以及m.14 484T>C； 所述CRIS PR‑Cas组合物包括独立存在的如下组分： Cas12a 蛋白和crRNA； crRNA选自检测m.11778G>A的SEQ  ID NO.1、 检测m.3460G>A的SEQ  ID NO.11、 以及 检测 m.14484T>C的SEQ  ID NO.17的至少一种。 2.根据权利要求1所述的CRISPR ‑Cas组合物， 其特征在于， 所述CRISPR ‑Cas组合物还包 括独立存在的dsDNA扩增引物对： 所述dsDNA扩增引物对选自如下引物对中的至少一种： 引物对1： SEQ  ID NO.26与SEQ  ID NO.27、 引物对2： SEQ  ID NO.33和SEQ  ID NO.35、 以 及引物对3： SEQ  ID NO.37和SEQ  ID NO.43。 3.根据权利要求2所述的CRISPR ‑Cas组合物， 其特征在于， 所述CRISPR ‑Cas组合物还包 括独立存在的可被Cas12a非特异 性地切割的荧光探针， 所述荧光探针的一端修饰有荧光基 团， 另一端修饰有猝灭基团； 优选地， 所述 荧光探针的核酸序列如SEQ  ID NO.44所示。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述的CRISPR ‑Cas组合物， 其特征在于， 所述CRISPR ‑Cas组 合物还包括独立存在的限制性内切酶SfaN I和/或BsaH  Ⅰ。 5.一种检测LHON致病突变的试剂盒， 其特征在于， 其包括权利要求1 ‑4任一项所述的 CRISPR‑Cas组合物。 6.一种检测LHON致病突变的方法， 所述方法不以疾病的诊断或治疗为目的， 其特征在 于， 其包括： 使用权利要求1 ‑4任一项所述的CRISPR ‑Cas组合物， 或者权利要求5所述的试剂 盒进行检测。 7.一种检测LHON致病突变的方法， 其特征在于， 所述LHON致病突变选择如下突变中的 至少一种： m.1 1778G>A、 m.346 0G>A、 以及m.14 484T>C； 当检测m.11778G>A突变时， 所述方法包括： 对待测核酸样品进行扩增后， 将扩增产物与 Cas12a蛋白和crRNA混合进行反应， 该crRNA的核酸序列如SEQ  ID NO.1所示； 当检测m.3460G>A突变时， 所述方法包括： 对待测核酸样品进行扩增后， 将扩增产物与 Cas12a蛋白和crRNA混合进行反应， 该rRNA的核酸序列如SEQ  ID NO.11所示； 当检测m.14484T>C突变时， 所述方法包括： 对待测核酸样品进行扩增后， 将扩增产物与 Cas12a蛋白和crRNA混合进行反应， 该rRNA的核酸序列如SEQ  ID NO.17所示。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述方法还包括： 在将上述任意一种扩增 产物与Cas12a蛋 白和crRNA混合后， 往混合体系中加 入可被Cas12a非特异性地切割的荧光 探针， 所述 荧光探针的一端修饰有荧 光基团， 另一端修饰有猝灭基团； 优选地， 所述 荧光探针的核酸序列如SEQ  ID NO.44所示。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 当检测 m.11778G>A突变时， 所述核酸样品 的扩增体系中含有限制性内切酶SfaN  Ⅰ； 当检测m.346 0G>A突变时， 所述核酸样品的扩增体系中含有限制性内切酶BsaHI。 10.根据权利要求7 ‑9任一项所述的方法， 其特 征在于， 当检测m.11778G>A突变时， 使用SEQ  ID NO.26与SEQ  ID NO.27所示的引物对进行扩权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114774530 A 2增； 当检测m.346 0G>A突变时， 使用SEQ  ID NO.33与SEQ ID NO.35所示的引物对进行扩增； 当检测m.14484T>C突变时， 使用SEQ  ID NO.37与SEQ  ID NO.43所示的引物对进行扩 增。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114774530 A 3