(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210118405.X (22)申请日 2022.02.08 (71)申请人 安徽省农业科 学院畜牧兽医研究所 地址 230000 安徽省合肥市农科南路40号 (72)发明人 戴银　殷冬冬　尹磊　王洁茹　 胡晓苗　程帮照　王骏俊　沈学怀　 潘孝成　赵瑞宏　 (74)专利代理 机构 合肥东邦滋原 专利代理事务 所(普通合伙) 3415 5 代理人 王天马 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/113(2010.01) (54)发明名称 鸭坦布苏病毒核 酸CRISPR-Cas13a检测系统 及RPA引物对和crRNA (57)摘要 本发明涉及鸭坦布苏病毒核酸检测技术领 域， 具体公开了一种鸭坦布苏病毒核酸CRISPR ‑ Cas13a检测系统及RPA引物对和crRNA， 本发明基 于设计的RPA引物对和特异性的crRNA建立了一 种基于CRISPR ‑Cas13a诊断平台可视、 灵敏且特 异的鸭坦布苏病毒快速临床检测系统， 该系统反 应全程无需复杂的温度控制仪器， 只需在3 7℃下 进行等温检测， 可用于荧光读数或视觉读数， 检 测系统的最低检出限为1.0 ×100copies/反应， 且与其他家禽病毒没有交叉反应， Cas13a检测系 统还可直接在临床样品的病毒检测中发挥作用， 其具有检测操作简便快速， 适合现场检测， 特异 性强， 检测灵敏度高， 准确率高、 可靠 。 权利要求书2页 说明书8页 附图3页 CN 114292963 A 2022.04.08 CN 114292963 A 1.采用CRISPR ‑Cas13a检测系统检测鸭坦布苏病毒核酸的RPA引物对， 其特征在于， 所 述的RPA引物对选自以下5对引物对中的任意 一对： (1)由RPA F1和RPA R1组成的引物对， 其中： RPA F1的核苷酸序列为： GAAATTAATACGACTCACTATAG GGGAAGCTGAAAGGAATGACCTACCCGATGT； RPA R1的核苷酸序列为： TGACTGTTATCAAGCGTCCAACTGGTGTC； (2)由RPA F2和RPA R2组成的引物对， 其中： RPA F2的核苷酸序列为： GAAATTAATACGACTCACTATAG GGGTTGCTTTGGGTGACACTGCATG GGATTT； RPA R2的核苷酸序列为： TTCCTCCTACGACTAGA AAGGTCATAGA AATGG； (3)由RPA F3和RPA R3组成的引物对， 其中： RPA F3的核苷酸序列为： GAAATTAATACGACTCACTATAG GGGGCAATGGCTGTGGCTTGTTTGGAAAGGG； RPA R3的核苷酸序列为： GGCGTTATCACGA ATCTAGCG GCATGTTT； (4)由RPA F4和RPA R4组成的引物对， 其中： RPA F4的核苷酸序列为： GAAATTAATACGACTCACTATAG GGCGCTGAAACATGCCGCTAGAT TCGTGATA A； RPA R4的核苷酸序列为： AACAAGCCAGCTCTTTGTATTCATGGTGA； (5)由RPA F5和RPA R5组成的引物对， 其中： RPA F5的核苷酸序列为： GAAATTAATACGACTCACTATAG GGTGGAAGGAGGCTCATGCGTGACTAT TA； RPA R5的核苷酸序列为： TATGTATTCAGCATA AGTTGCCTTGGGAT。 2.根据权利要求1所述的采用CRISPR ‑Cas13a检测系统检测鸭坦布苏病毒核酸的RPA引 物对， 其特 征在于， 所述的RPA引物是由RPA  F2和RPA R2组成的引物对， 其中： RPA F2的核苷酸序列为： GAAATTAATACGACTCACTATAG GGGTTGCTTTGGGTGACACTGCATG GGATTT； RPA R2的核苷酸序列为： TTCCTCCTACGACTAGA AAGGTCATAGA AATGG。 3.采用CRISPR ‑Cas13a检测系统检测鸭坦布苏病毒核酸的crRNA， 其特征在于， 所述 crRNA为crRNA1、 crRNA 2、 crRNA3、 crRNA4或crRNA5中的任意 一种； 所述的crRNA1的核苷酸序列为： GATTTAGACTAC CCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACTGTCGGTAGGATTCTTCACTAGGGAAAA； 所述的crRNA 2的核苷酸序列为： GATTTAGACTAC CCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCCAAAAACCTGATGAATGCCTTTCCCAA；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114292963 A 2所述的crRNA3的核苷酸序列为： GATTTAGACTAC CCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACAAACTGCAACTTCAAACTGGACATTTT； 所述的crRNA4的核苷酸序列为： GATTTAGACTAC CCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACTTCGAGTGTGACG GTGCCATAATCCTCC； 所述的crRNA5的核苷酸序列为： GATTTAGACTAC CCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCTCACAACCGCTAATTCCGTAGCCTCCA。 4.根据权利要求3所述的采用CRISPR ‑Cas13a检测系统检测鸭坦布苏病毒核酸的 crRNA， 其特 征在于， 所述的crRNA为crRNA 2， 其核苷酸序列为： GATTTAGACTAC CCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCCAAAAACCTGATGAATGCCTTTCCCAA。 5.根据权利要求1或2所述的采用CRISPR ‑Cas13a检测系统检测鸭坦布苏病毒核酸的 RPA引物对， 其特 征在于， 所述RPA引物对应用于制备检测鸭坦布苏病毒 核酸试剂。 6.根据权利要求3或4所述的采用CRISPR ‑Cas13a检测系统检测鸭坦布苏病毒核酸的 crRNA， 其特 征在于， 所述crRNA应用于制备检测鸭坦布苏病毒 核酸试剂。 7.一种根据权利要求1 ‑6任一项所述的鸭坦布苏病毒核酸CRISPR ‑Cas13a检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括： RPA引物对、 crRNA、 Cas13a蛋白、 NTP  buffer mix、 T7 RNA  polymerase mix、 RNase  inhibitor、 RNA  Reporter和鸭坦布苏病毒质粒 标准品。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114292963 A 3