(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221012140 6.X (22)申请日 2022.02.09 (71)申请人 广东省农业科 学院动物卫 生研究所 地址 510640 广东省广州市天河区五山白 石岗街9号 (72)发明人 李春玲　施科达　李艳　翟少伦　 蔡汝健　卞志标　勾红潮　宋帅　 张昆丽　蒋智勇　楚品品　杨冬霞　 (74)专利代理 机构 北京盛询知识产权代理有限 公司 11901 代理人 陈巍 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6848(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢 式PCR引物组、 试剂盒 (57)摘要 本发明公开了检测非洲猪瘟病毒的锁核酸 修饰的一步巢式PCR引物组、 试剂盒， 涉及分子生 物领域； 包括外引物对、 内引物对和探针， 所述外 引物对的上游引物序列为SEQ  ID NO： 1所示序 列， 所述外引物对的下游引物序列为SEQ  ID NO： 2所示序列； 所述内引物对的上游引物序列为SEQ   ID NO： 3所示序列， 所述内引物对的下游引物序 列为SEQ ID NO： 4所示序列； 所述探针的序列为 SEQ ID NO： 5所示序列。 本发明基于巢式PCR原 理， 通过设计两对嵌套式引物， 同时对外引物进 行锁核酸修饰， 提高外引物的Tm值和稳定性， 进 行两次独立的循环镶套式扩增， 具有较高的灵敏 度和特异性， 易于操作， 交叉污染少。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图3页 CN 114410845 A 2022.04.29 CN 114410845 A 1.检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢式PCR引物组， 其特征在于， 包括外引物 对、 内引物对和探针， 所述外引物对的上游引物序列为SEQ  ID NO： 1所示序列， 所述外引物 对的下游引物序列为SEQ  ID NO： 2所示序列； 所述内引物对的上游引物序列为SEQ  ID NO： 3 所示序列， 所述内引物对的下游引物序列为S EQ ID NO： 4所示序列； 所述外引物对的上游引 物序列中， 第二位、 第九位、 第十三位、 第十六位和第十 八位的碱基均为锁核酸， 所述外引物 对的下游引物序列中， 第一位、 第七位、 第十位、 第十三位和第十七位的碱基均为锁核酸； 所 述探针的序列为SEQ  ID NO： 5所示序列。 2.权利要求1所述的检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢式PCR引物组在制备非 洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。 3.一种检测非洲猪瘟病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 包含权利要求1所述的检测非洲猪瘟 病毒的锁核酸 修饰的一 步巢式PCR引物组。 4.根据权利要求3所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒， 其特征在于， 在所述试剂盒的 PCR反应体系中， 所述探针在反应 体系中的浓度为10 0nmol/L。 5.根据权利要求3所述的检测非洲猪瘟病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包括 Probe Master Mix和去核酸酶水。 6.根据权利要求3所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒， 其特征在于， 在所述试剂盒的 PCR反应体系中， 外引物对的退火温度为67℃。 7.根据权利要求3所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒， 其特征在于， 在所述试剂盒的 PCR反应体系中， 内引物对的退火温度为59℃。 8.根据权利要求3所述的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒， 其特征在于， 在所述试剂盒的 PCR反应体系中， 内引物对的上游引物和下游引物的浓度均为3 00nmol/L。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410845 A 2检测非洲猪瘟病毒 的锁核酸修饰的一步巢式PCR引物组、 试 剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物领域， 特别是涉及检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰的一步巢 式PCR引物组、 试剂盒。 背景技术 [0002]非洲猪瘟(African  Swine Fever， ASF)， 是由非洲猪瘟病毒(African  Swine  Fever Virus， ASFV)感染家猪和各种野猪而引起的急性、 烈性传 染病， 发病迅速， 死亡率高 达90％～100％， 严重危害我国养猪业， 被我国农业部列为一类传染病。 ASFV属于双链DNA病 毒目非洲猪瘟病毒科， 非洲猪瘟病毒属， ASFV个体较大， 结构 复杂， 表面为二十面体结构和 一层含类脂的囊膜， 基因组编码大量蛋白， 易变异， 自然伫主基因型多样。 非洲猪瘟病毒对 外界的抵抗力较强， 在环境中存活时间长， 据报道， 在血液、 粪便和组织中存活时间长达半 年， 在感染的生的或者未完全煮熟的猪肉制品中存活时间长达3个月， 在冻肉中可存活数 年。 而且， 非洲猪瘟病毒基因型多， 易变异， 我国非洲猪瘟疫苗处于研发阶段， 但研制成功和 获得应用尚需时日。 目前， 防控非洲猪瘟的主要手段， 仍然 是监控和灭源。 所以， 防控依赖早 期的高灵敏度和高特异性的诊断检测， 进 而灭源头根除， 故 实验室诊断尤为重要。 [0003]目前对非洲猪瘟病毒的实验室诊 断方法主要有， 抗体检测： 荧光免疫方法、 Elisa 抗体检测方法， 核酸检测： 荧光定量PCR方法、 普通PCR方法。 荧光定量PCR和普通PCR作为实 验室常规， 快速的检测方法之一。 检测限大约在200～1000拷贝 数/反应。 但猪场采样 到实验 室检测存在时间差， 导致核酸降解， 或者样本采集质量较差， 核酸提取不当， 或者样本类型 和病程不同， 导致检测样本病毒载量可能低于传统荧光PCR的检测限， 导致假阴性结果。 采 用数字PCR可以对样本含微量的病毒载量进 行检测， 但是往往需要独立的配套 试剂、 设备和 软件， 以及专业的人员， 且价格昂贵。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰 的一步巢式PCR引物组、 试 剂盒， 以解决上述现有技术存在的问题， 本发明基于巢式PCR原理， 通过设计两对嵌套式引 物， 同时对外引物进 行锁核酸修饰， 提高外引物的Tm值和稳定性， 进 行两次独立的循环镶套 式扩增， 具有较高的灵敏度和特异性， 易于操作， 交叉污染少。 [0005]为实现上述目的， 本发明提供了如下 方案： [0006]本发明提供检测非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰 的一步巢式PCR引物组， 包括外引物 对、 内引物对和探针， 所述外引物对的上游引物序列为SEQ  ID NO： 1所示序列， 所述外引物 对的下游引物序列为SEQ  ID NO： 2所示序列； 所述内引物对的上游引物序列为SEQ  ID NO： 3 所示序列， 所述内引物对的下游引物序列为S EQ ID NO： 4所示序列； 所述外引物对的上游引 物序列中， 第二位、 第九位、 第十三位、 第十六位和第十 八位的碱基均为锁核酸， 所述外引物 对的下游引物序列中， 第一位、 第七位、 第十位、 第十三位和第十七位的碱基均为锁核酸； 所说　明　书 1/6 页 3 CN 114410845 A 3