(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210122779.9 (22)申请日 2022.02.09 (71)申请人 深圳市妇幼保健院 地址 518000 广东省深圳市福田区红荔路 2004号 (72)发明人 苏进娣　段山　郑开封　杨元凯　 陈仕国　高建　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 代理人 宋家会 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于核酸质谱检测Leber遗传性视神经病变 的引物组 (57)摘要 本发明提供一种基于核酸质谱检测Leber遗 传性视神经病变的引物组。 本发 明采用兼并扩增 引物， 增加侧翼序列长度、 增加扩增子长度的设 计方案， 提高多重PCR多重扩增能力和扩增特异 性； 通过对34个位点同时进行检测， 能够同时对 中国人Leber遗传性视神经病变相关的线粒体点 突变进行全面检测并准确分型， 能够有效避免目 前检测Leber遗传性视神经病变只检测高发热点 突变， 而漏筛大量同时存在双重或多重突变患者 的情况从而做到指导临床进行准确分型， 避免了 漏诊或误诊。 对这种严重影 响青壮年视力疾病的 早期诊断、 干预和治 疗具有重要意 义。 权利要求书2页 说明书14页 序列表15页 附图13页 CN 114250296 A 2022.03.29 CN 114250296 A 1.基于核酸质谱检测Leber遗传性视神经病变的引物 组， 其特征在于， 所述引物组包括 独立位点集、 第一合并位点集、 第二合并位点集、 第三合并位点集和第四合并位 点集； 所述独立位点集包括： 与25个位点m.11778G>A、 m.13651A>G、 m.10680G>A、 m.4258A>G、 m.11696G>A、 m.4171C>A、 m.8821T>G、 m.3571C>T、 m.3733G>A、 m.3316G>A、 m.5061C>T、 m.13759G>A、 m.3866T>C、 m.3394T>C、 m.15951A>G、 m.14683A>G、 m.3635G>A、 m.4435A>G、 m.12811T>C、 m.4216T>C、 m.3736G>A、 m.15927G>A、 m.10663T>C、 m.14693A>G、 m.12338T>C依 次对应的25个扩增引物中如SEQ  ID No.1‑25所示的PCR上游引物、 与上述25个位点依次对 应的25个所述扩增引物中如SEQ  ID No.26‑50所示的PCR下游引物， 以及与上述25个位点依 次对应如SEQ  ID No.59‑83所示的25个延伸引物； 所述第一合并位点集， 用于合并检测位点m.14459G>A、 m.14484T>C和m.14502T>C； 所述 第一合并位点集包括： 如SEQ  ID No.51所示的扩增引物中的PCR上游引物， 如SEQ  ID No.55 所示的所述扩增引物中的PCR下游引物； 如SEQ  ID No.84所示的与位点m.14459G>A对应的 延伸引物； 如SEQ  ID No.85所示的与位点 m.14484T>C对应的延伸引物； 如SEQ  IDNo.86所示 的与位点m.14502T>C对应的延伸引物； 所述第二合并位点集， 用于合并检测位点m.12308A>G和m.12340A>G； 所述第二合并位 点集包括： 如SEQ  ID No.52所示的扩增引物中的PCR上游引物， 如SEQ  ID No.56所示的所述 扩增引物中的PCR下游引物； 如SEQ  ID No.87所示的与位点m.12308A>G对应的延伸引物； 如 SEQ ID No.88所示的与位 点m.12340A>G对应的延伸引物； 所述第三合并位点集， 用于合并检测位点m.3460G>A和m.3497C>T； 所述第三合并位点 集包括： 如SEQ  ID No.53所示的扩增引物中的PCR上游引物， 如SEQ  ID No.57所示的所述扩 增引物中的PCR下游引物； 如SEQ  IDNo.89所示的与位点m.3460G>A对应的延伸引物； 如SEQ   ID No.90所示的与位 点m.3497C>T对应的延伸引物； 所述第四合并位点集， 用于合并检测位点m.14482C>A和m.14495A>G； 所述第四合并位 点集包括： 如SEQ  ID No.54所示的扩增引物中的PCR上游引物， 如SEQ  ID No.58所示的所述 扩增引物中的PCR下游引物； 如SEQ  IDNo.91所示的与位点m.14482C>A对应的延伸引物； 如 SEQ ID No.92所示的与位 点m.14495A>G对应的延伸引物。 2.如权利要求1所述基于核酸质谱检测Leber遗传性视神经病变的引物组， 其特征在 于， 所述引物组分为如下两组， 分别为第一引物组和第二引物组： 所述第一引物组为检测m.11778G>A、 m.13651A>G、 m.10680G>A、 m.4258A>G、 m.11696G> A、 m.4171C>A、 m.8821T>G、 m.3571C>T、 m.3733G>A、 m.3316G>A、 m.5061C>T、 m.13759G>A、 m.3866T>C、 m.3394T>C、 m.15951A>G、 m.14683A>G、 m.14459G>A、 m.14484T>C、 m.14502A>G、 m.12308A>G、 m.12340A>G、 m.346 0G>A、 m.3497C>T致病位 点的第一引物组； 所述第二引物组为检测m.3635G>A、 m.4435A>G、 m.12811T>C、 m.4216T>C、 m.3736G>A、 m.15927G>A、 m.10663T>C、 m.14693A>G、 m.12338 T>C、 m.14482 C>A、 m.1449 5A>G致病位点的第 二引物组。 3.如权利要求1或2所述基于核酸质谱检测Leber遗传性视神经病变的引物组在制备检 测Leber遗传性视神经病变相关线粒体突变位 点产品中的应用。 4.一种用于检测Leber遗传性视神经病变的组合物/产品/试剂盒， 其特征在于， 包括如 权利要求1 ‑2任一所述基于核酸质谱检测Leber遗传性视神经病变的引物组。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114250296 A 25.如权利 要求4所述用于检测Leber遗传性视神经病变的组合物/产品/试剂盒， 其特征 在于， 还包括用于检测突变位 点的试剂。 6.如权利 要求4所述用于检测Leber遗传性视神经病变的组合物/产品/试剂盒， 其特征 在于， 还包括扩增反应 体系； 所述扩增反应 体系包括： DNA聚合酶、 PCR缓冲液、 MgCl2、 dNTP、 Tris ‑HCl和KCI。 7.如权利 要求4所述用于检测Leber遗传性视神经病变的组合物/产品/试剂盒， 其特征 在于， 还包括消化反应 体系； 所述消化反应 体系包括： SAP酶和SAP缓冲液。 8.如权利 要求4所述用于检测Leber遗传性视神经病变的组合物/产品/试剂盒， 其特征 在于， 还包括延伸反应 体系； 所述延伸反应 体系包括： iPLEX酶、 iPLEX终止液和iPLEX缓冲液。 9.如权利 要求4所述用于检测Leber遗传性视神经病变的组合物/产品/试剂盒， 其特征 在于， 其中所述产品还 包括用于检测Leber遗传性视神经病变的致病位 点的设备； 所述设备包括基于MassARRAY对Leber遗传性视神经病变 的致病位点核苷酸进行检测 的设备。 10.一种Leber遗传性视神经病变相关线粒体DNA突变位点的检测方法， 其特征在于， 包 括： 提取样本基因 组DNA； 以所提取的DNA为模板， 基于如权利 要求1或2所述基于核酸质谱检测Leber遗传性视神 经病变的引物组， 取扩增引物SEQ  ID NO.1‑SEQ IDNO.58、 DNA聚合酶和PCR缓冲 液， 分别配 制后进行PCR扩增反应， 获得目标位 点的PCR产物片段； 对所述PCR产物片段进行虾碱性磷酸酶进行消化处 理， 去除多余的dNTP， 得到产品一； 将所述产品一进行单碱基延伸反应， 所用的延伸引物如SEQ  IDNO.59‑SEQ ID NO.92所 示； 将进行单碱基延伸反应的所述产品一进行树脂纯化， 得到产品二； 将所述产品二进行质谱分析， 得到SNP位 点所对应的分子量质谱峰图。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114250296 A 3