(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210120566.2 (22)申请日 2022.02.09 (71)申请人 广东省科 学院生态 环境与土 壤研究 所 地址 510650 广东省广州市天源路808号 (72)发明人 陈俊华　潘家峰　邓芳　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 齐键 (51)Int.Cl. G01N 33/53(2006.01) C12Q 1/6818(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 分子逻辑门智能化检测真菌毒素新方法 (57)摘要 本发明公开了一种分子逻辑门智能化检测 真菌毒素新方法， 该方法包括如下步骤： (1)将发 夹探针组加热至92～95℃， 然后冷却至室温， 使 其形成发夹 结构； (2)将检测样品、 形成发夹结构 的发夹探针组、 酶链和底物链在25 ±2℃条件下 孵育90～95min， 检测荧光信号。 本发明中的检测 方法及检测试剂盒能够准确的智能化检测待测 样品中是否含有OTA、 AFB1和ZEN， 且特异性好， 对 于其他真菌毒素等类似物均不会产生假阳性。 且 灵敏度高， 检出限可达100pM， 相比于常规的检测 技术更加灵敏智能。 权利要求书2页 说明书12页 序列表2页 附图3页 CN 114441745 A 2022.05.06 CN 114441745 A 1.一种真菌毒素检测试剂， 其特 征在于， 所述试剂中含有发夹 探针组； 所述发夹探针组包括发夹探针A、 发夹探针B、 发夹探针C、 发夹探针D、 发夹探针E、 发夹 探针F、 发夹 探针G和发夹 探针H中的至少一种； 所述发夹 探针A～H的核苷酸序列为： 发夹探针A： 5' ‑GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAGCTCCCTTTACAAAAAAAAAAA ‑ 3'(SEQ ID NO.1)； 发夹探针B： 5' ‑GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACAGCTCCCTTT ACAAAAAAAAAAATGCCCAAC‑3'(SEQ ID NO.2)； 发夹探针C： 5' ‑TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATATGTTTTTTTTTTGCCACCCAC ACATAGATG ‑3'(SEQ ID NO.3)； 发夹探针D： 5' ‑GGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCCCATGTATCGAGCTCCCTTTACGCCTGTGT ‑3' (SEQ ID NO.4)； 发夹探针E： 5' ‑TGTGTGTGTGTAAGGGAGCTCGATACATGGGCTCCCTTTACGCCCCATGTATCGA ‑3' (SEQ ID NO.5)； 发夹探针F： 5' ‑GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAGCTCCCTTTACGCCACCCACAC ‑ 3'(SEQ ID NO.6)； 发夹探针G： 5' ‑GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACAGCTCCCTTT ACGCCACCCACACTGC CCAAC‑3'(SEQ ID NO.7)； 发夹探针H： 5' ‑TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATATGGTGTGGGTGGCGTAAAGGG AGCATTACAGAT‑3'(SEQ ID NO.8)。 2.根据权利要求1所述的真菌毒素检测试剂， 其特征在于， 所述真菌毒素包括黄曲霉毒 素B1、 赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮毒素。 3.一种真菌毒素检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中包括权利要求1或2所述的真 菌毒素检测试剂、 酶链和底 物链。 4.根据权利要求3所述的真菌毒素检测试剂盒， 其特征在于， 所述酶链的核苷酸序列 为： 酶链DNA1： 5' ‑ACACAGGCGTAGACTC CGAGCCGGACGAAGTTACCCACACCCC‑'3(SEQ ID NO.9)。 5.根据权利要求3所述的真菌毒素检测试剂 盒， 其特征在于， 所述底物链的核苷酸序列 为： 底物链DNA2： 5' ‑TCGATACATGGAACTrAGGTCACACACACACA ‑'3(SEQ ID NO.10)； 其中， rA代 表核酸A修饰。 6.根据权利要求5所述的真菌毒素检测试剂 盒， 其特征在于， 所述底物链上修饰有荧光 基团和猝灭基团， 所述 荧光基团和猝灭基团分别修饰于酶切位 点的对立两侧。 7.根据权利要求1～2任一项所述的真菌毒素检测试剂或权利要求3～6任一项所述的 真菌毒素检测试剂盒在食品安全检测中的应用。 8.一种真菌毒素的检测方法， 包括如下步骤： (1)将权利要求1中的发夹探针组加热至92～95℃， 然后冷却至室温， 使其形成发夹结 构； (2)将检测 样品、 形成发夹结构的发夹探针组、 权利要求4中的酶链和权利要求5中的底 物链在25±2℃条件下孵 育90～95min， 检测荧 光信号。 9.根据权利要求8所述的检测方法， 其特 征在于， 所述检测样品为食品。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114441745 A 210.根据权利要求8所述的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法执行 “OR‑AND”和/或 “OR‑INHIBIT”分子逻辑门； 所述“OR‑AND”分子逻辑门的检测体系为： 组分 终含量 检测样品 10 μL 发夹探针A 200～300nM 发夹探针B 200～300nM 发夹探针C 200～300nM 发夹探针D 200～300nM 发夹探针E 400～600nM 酶链DNA1 200～300nM 底物链DNA2 200～300nM 氯化镁 10mM ddH2O 补至100 μL 所述“OR‑INHIBIT”分子逻辑门的检测体系为： 权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114441745 A 3