(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210119666.3 (22)申请日 2022.02.09 (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大 学南路88号 (72)发明人 高崧　潘昊纯　郇长超　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 代理人 吴波 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种快速区分猪圆环病毒1型、 2b型和嵌合 型猪圆环病毒C1-23 3株的引物及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种快速区分猪圆环病毒1 型、 2b型和嵌合型猪圆环病毒C1 ‑233株的引物及 其应用， 属于生物技术领域。 本发明提供的引物 能够确保PCR扩增的猪圆环病毒1型毒株基因组 不含Ssp I酶切位点， 扩增的猪圆环病毒2b型 0233株基因组含有两个Ssp  I酶切位点， 扩增的 嵌合型猪圆环病毒C1 ‑233株的基因组含有一个 Ssp I酶切位点。 进而根据酶切后的琼脂糖凝胶 电泳条带便能快速、 准确区分混合样品中猪圆环 病毒1型、 猪圆环病毒2b型0233株和 嵌合型猪圆 环病毒C1 ‑233株， 在嵌合型猪圆环病毒活疫苗 (C1‑233株)研制、 生产过程中， 为快速、 精确区分 疫苗株与其亲本株提供了一种简便方法， 克服了 普通PCR+基因测序无法区分混合样品中疫苗株 与亲本株的缺陷， 具有重要实用价 值。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 114317833 A 2022.04.12 CN 114317833 A 1.一种快速区分猪圆环病毒1型毒株、 2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒C1 ‑233株的引 物， 其特征在于， 所述引物的上游引物为5 ’ ‑TGT CCCAGC TGTAGAAGC  TCT‑3’， 所述引物的下 游引物为5 ’ ‑GCA GTT GAG GAG TAC CATTCC‑3’。 2.权利要求1所述引物在制备快速区分猪圆环病毒1型毒株、 2b型0233株和嵌合型猪圆 环病毒C1 ‑233株产品中的应用。 3.一种快速区分猪圆环病毒1型毒株、 2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒C1 ‑233株的方 法， 其特征在于， 所述方法包括如下步骤： 采用权利要求 1所述引物对待测物基因进 行PCR扩 增， 利用限制性内切酶Ssp  I对PCR扩增产物进 行酶切， 然后进 行琼脂糖凝胶电泳， 猪圆环病 毒1型毒株为1759bp单一条带， 猪圆环病毒2b型02 33株为659bp、 594bp和514bp三条带， 嵌合 型猪圆环病毒C1 ‑233株为1098bp和6 69bp两条 带。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述PCR的反应体系包括： 终浓度为0.4μM 的上、 下游引物， DNA模板， 2 ×Taq MasterMix和无菌双蒸水。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述终浓度为0.4 μM的上、 下游引物， DNA模 板， 2×Taq Master Mix和无菌双蒸水的体积比为0.1 ‑1： 1‑5： 12.5： 5.5 ‑11.3。 6.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述PCR的反应条件包括： 95℃预变性 5min； 95℃变性30s， 52 ‑58℃退火30 ‑60s， 72℃延伸1min46s ‑2min， 35个循环； 72℃延伸 5min， 12℃保存。 7.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述酶切的方法包括如下步骤： 将PCR扩增 产物与10 ×Ssp I Buffer、 Ssp I和无菌双蒸水混合， 孵 育。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增产物与10 ×Ssp I Buffer和 Ssp I的质量体积比为1 ‑2 μg： 2 μL： 1 ‑2 μL。 9.根据权利要求7 所述的方法， 其特 征在于， 所述孵 育的温度为37℃。 10.根据权利要求7 所述的方法， 其特 征在于， 所述孵 育的时间为2 ‑3h。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114317833 A 2一种快速区分猪圆环病毒1型、 2b型和嵌合型猪圆环病毒C1 ‑ 233株的引物及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 尤其涉及一种快速区分猪圆环病毒1型、 2b型和嵌合型 猪圆环病毒C1 ‑233株的引物及其应用。 背景技术 [0002]猪圆环病毒1型(Porcine  circovirus  1,PCV1)毒株和猪圆环病毒2型(Porcine   circovirus  2,PCV2)毒株属于 圆环病毒科、 圆环病毒属， 其中猪 圆环病毒1型无致病性， 猪 圆环病毒2型是断奶仔猪多系统衰竭 综合征(PMWS)的主要病原。 嵌合型猪圆环病毒C1 ‑233 株为活疫苗株。 猪圆环病毒1型毒株， 基因组大小为1759bp； 猪圆环病毒2b型0233株和嵌合 型猪圆环病毒C1 ‑233株， 基因组大小均为1767bp。 目前， 猪 圆环病毒的检测方法主要是PCR 结合基因测序方法， 但当同一样品中同时存在PCV1、 PCV2两种毒株时， 应用该方法无法区 别， 原因是PCV1、 P CV2毒株的基因组同源性在70％以上， 普通PCR均能扩增出来， 且其基因组 大小相似， 无法通过凝胶电泳区分开； 即使将扩增产 物测序， 由于其同源性高， 出现重叠峰， 亦无法将其区分开。 嵌合型猪圆环病毒活疫苗C1 ‑233株在PCV1基因组骨架上替换其Cap蛋 白编码基因ORF2构建而成， 其基因组与亲本株PCV1、 PCV2的同源性同样 很高， 用上述方法依 然无法区分混合样品中的疫苗株与亲本株。 建立区分PCV1、 PCV2、 PCV1 ‑233株简便方法的意 义在于且不限于： (1)嵌合型猪圆环病毒活疫苗(C1 ‑233株)研制过程中， 需要 杜绝亲本株污 染， 必须对疫苗株中可能污染的亲本株进行甄别； (2)一旦嵌合型猪圆环病毒活疫苗(C1 ‑ 233株)投入使用， 临床上出现疫苗株、 野毒株 混合感染的可能性较大， 同样需要区分疫苗株 与野毒株。 目前， 如需达到上述 目标， 可行的方法唯有高通量测序。 但高通量测序不仅 成本 高、 耗时长， 也无法满足基层实验室对临床样品的检测 需求。 因此， 发明一种操作简便、 快 速、 准确区分混合样品中猪圆环病毒1型毒株、 猪圆环病毒2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒 C1‑233株的检测方法显得极为重要。 发明内容 [0003]有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种能够快速、 准确区分猪圆环病毒1型毒株、 2b型0233株和嵌合型猪圆环病毒C1 ‑233株的引物。 [0004]为了实现上述发明目的， 本发明提供了以下技 术方案： [0005]本发明提供了一种快速区分猪圆环病毒1型毒株、 2b型0233株和嵌合型猪圆环病 毒C1‑233株的引物， 所述引物的上游引物为5 ’ ‑TGT CCCAGC TGTAGAAGC  TCT‑3’， 所述引物 的下游引物为5 ’ ‑GCA GTT GAG GAG TAC CATTCC‑3’。 [0006]本发明还提供了一种上述引物在制备快速区分猪圆环病毒1型毒株、 2b型0233株 和嵌合型猪圆环病毒C1 ‑233株产品中的应用。 [0007]本发明还提供了一种快速区分猪圆环病毒1型毒株、 2b型0233株和嵌合型猪圆环 病毒C1‑233株的方法， 所述方法包括如下步骤： 采用上述引物对待测物基因进行PCR扩增，说　明　书 1/4 页 3 CN 114317833 A 3