(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210125427.9 (22)申请日 2022.02.10 (71)申请人 杜彦丹 地址 022150 内蒙古自治区呼伦 贝尔市牙 克石市文明西街御景园D栋 32号 申请人 陈昊 (72)发明人 杜彦丹　赵志军　李翔　董占柱　 孙欣　陈昊　包春喜　郝明媛　 李英智　牛艺卿　 (74)专利代理 机构 内蒙古欣洋 瑞专利代理有限 公司 151 10 专利代理师 刘永珍 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01)C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6837(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 基于微流控芯片-PCR技术检测布鲁氏菌的 方法及系统 (57)摘要 本发明提供了一种基于微流控芯片 ‑PCR技 术检测布鲁氏菌的方法及系统。 本发 明的检测布 鲁氏菌的方法包括对待测样 本进行目的DNA的提 取、 PCR扩增以及反向斑点杂交， 其中： 采用NaI磁 珠法对待测样本进行目的DNA的提取； 以提取获 得的DNA为模板， 采用针对布 鲁氏菌BCSP ‑31基因 设计的引物， 进行PCR扩增； PCR扩增产物在杂交 膜上进行反向斑点杂交； 其中， 杂交膜上固定有 针对布鲁氏菌BCSP ‑31基因设计的检测探针。 本 发明的检测方法可利用微流控芯片 全自动进行， 安全、 快捷、 及时、 精准， 本发明技术的应用将提 高布鲁氏菌的诊断率和诊断准确率， 对布鲁氏菌 病的防治起到 重要作用。 权利要求书2页 说明书15页 序列表2页 附图4页 CN 114480686 A 2022.05.13 CN 114480686 A 1.一种检测布鲁氏菌的方法， 其特征在于， 该方法包括对待测样本进行目的DNA的提 取、 PCR扩增以及反向斑点杂交， 其中： 目的DNA的提取： 采用NaI磁珠法对待测样本进行目的DNA的提取； PCR扩增： 以提取获得的DNA为模板， 采用针对布鲁氏菌BCSP ‑31基因设计 的引物， 进行 PCR扩增； 反向斑点杂交： PCR扩增产物在杂交膜上进行反向斑点杂交； 其中， 杂交膜上固定有针 对布鲁氏菌BCS P‑31基因设计的检测探针。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述待测样本为来自个体的离体样本或环 境样本； 所述 来自个体的离体样本为血 液样本。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， NaI磁珠法中， 采用的提取试剂包括1.5 ‑ 6mol/L的NaI裂解液， 蛋白酶K， 磁珠， 以及异丙醇； 优选地， 针对每50 μl待测样本， 采用的提取试剂包 括50 μl ddH2O、 100 μl NaI裂解液、 5 μl   PK、 5‑20 μl磁珠以及20 ‑100 μl异丙醇。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述目的DNA的提取利用微流控芯片技术 全自动进行， 或是手工提取； 其中， 手工提取 过程优选包括： 在离心管中加入待测样本， 并加入裂解液NaI， 混匀， 并加入蛋白酶K， 进行孵 育； 在上述离心管中加入磁珠和异丙醇， 混匀； 将离心管放于磁力架上静置， 待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液， 并 根据需要 进行漂洗； 离心管开盖室温晾干， 加入洗脱液， 孵 育； 将离心管放于磁力架上静置， 待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液 转移至新的离心管中 ‑20℃保存备用。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， PCR扩增过程中， 针对布鲁氏菌BCSP ‑31基 因设计的引物具有如SEQ  ID No.1和SEQ ID No.2所示序列。 6.根据权利 要求1或4所述的方法， 其特征在于， PCR扩增过程中， 采用15 μPCR反应体系， 包括： DNA 聚合酶(2 ×Taq Master Mix)7.5ul， 正、 反向引物各1.5μl(0.5μmol/μl)， ddH2O   1.5 μl， 核酸模板3 μl； 反应循环参数： 95℃预变性3min， 95℃10s、 50℃30s、 72℃30s， 45个热 循环， 72℃终延伸1mi n； 优选地， 所述PCR扩增过程利用微 流控芯片技 术全自动进行。 7.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 反向斑点杂交过程中， 针对布鲁氏菌BCSP ‑ 31基因设计的检测探针具有如SEQ  ID No.3所示序列； 优选地， 所述反向斑点杂交过程利用微 流控芯片技 术全自动进行。 8.根据权利要求1或7所述的方法， 其特征在于， 反向斑点杂交过程中， 杂交膜上还固定 有质控探针； 优选地， 杂交膜划分为多个点位， 各探针采用微量点样技术被固定在杂交膜的不同点 位上， 其中检测 探针至少1个点， 空白对照探针、 内参质控探针GB各至少1个点， 显色质控探 针重复至少3个点。 9.一种用于实现权利要求1 ‑8任一项所述检测布鲁氏菌的方法的检测系统， 其特征在权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114480686 A 2于， 该检测系统包括： 用于实现所述目的DNA的提取的提取 试剂材料； 用于实现所述PCR扩增的扩增试剂材 料； 用于实现 反向斑点杂交的试剂材 料。 10.根据权利要求9所述的检测系统， 其特征在于， 该检测系统还包括分析单元， 所述分 析单元按照以下 方法对反向斑点杂交结果进行分析判断： 如果杂交膜 的显色质控探针点有阳性斑点， 内参质控点有阳性斑点， 且有检测探针阳 性斑点出现， 提 示样本为布鲁氏菌阳性； 或者 如果杂交膜 的显色质控探针点有阳性斑点， 内参质控点有阳性斑点， 且无检测探针阳 性斑点出现， 提 示样本为布鲁氏菌阴性。 11.一种用于实现权利要求1 ‑8任一项所述检测布鲁氏菌的方法的引物和检测探针组 合物， 其特征在于， 所述引物具有如SEQ  ID No.1和SEQ  ID No.2所示序列； 所述检测探针具 有如SEQ ID No.3所示序列。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114480686 A 3