(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210127491.0 (22)申请日 2022.02.10 (71)申请人 江苏博嘉 生物医学 科技有限公司 地址 226000 江苏省南 通市崇川区观音山 街道新胜路158号迈普科技园1幢202 室 (72)发明人 肖以磊　于福华　张树葆　周杰　 许鹏　徐振涛　侯磊　程诚　姚杰　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 姜婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/113(2010.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于CRISPR检测脑卒中相关TBXAS1基因的 试剂盒 (57)摘要 本发明属于基因检测技术领域， 公开了基于 CRISPR检测脑卒中相关TBXAS1基因的试剂盒， 所 述试剂盒包括针对TBXAS1基因rs2267682和 rs10487667位点设计的突变型crDNA或突变型 crRNA， 其序列如SEQ  ID NO.1～4所示， 结合 CRISPR‑cas12a系统， 能确定待测样本中是否存 在TBXAS1基因rs2267682和/或rs10487667位点 的基因突变， 具备特异性强、 准确性高、 检测速度 快等优点， 应用前 景广阔。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图2页 CN 114480623 A 2022.05.13 CN 114480623 A 1.一种检测试剂盒， 其特 征在于， 所述检测试剂盒包括 突变型crDNA或突变型crRNA； 所述突变型crDNA包括： rs2267682突变型crDNA， 其序列如SEQ  ID NO.1所示； 和/或rs104876 67突变型crDNA， 其序列如SEQ  ID NO.2所示； 所述突变型crRNA包括： rs2267682突变型crRNA， 其序列如SEQ  ID NO.3所示； 和/或rs104876 67突变型crRNA， 其序列如SEQ  ID NO.4所示。 2.根据权利要求1所述的检测试剂盒， 其特 征在于， 所述检测试剂盒包括： 用于特异性扩增TBXAS1基因上rs2 267682位 点的引物对： rs2267682‑F， 其序列如SEQ  ID NO.5所示； rs2267682‑R， 其序列如SEQ  ID NO.6所示； 和/或用于特异性扩增TBXAS1基因上rs104876 67位点的引物对： rs104876 67‑F， 其序列如SEQ  ID NO.7所示； rs104876 67‑R， 其序列如SEQ  ID NO.8所示。 3.根据权利要求1所述的检测试剂盒， 其特 征在于， 所述检测试剂盒包括cas12a 蛋白。 4.根据权利要求1所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒包括荧光探针， 所 述荧光探针的5 ’端标记有荧 光报告基团， 所述 荧光探针的3 ’端标记有荧 光猝灭基团。 5.根据权利要求1所述的检测试剂盒， 其特 征在于， 所述检测试剂盒包括DNA酶抑制剂。 6.根据权利要求1所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒包括阴性对照品， 所述阴性对照品为野生型crDNA或野生型crRNA； 所述野生型crDNA包括： rs2267682野生型crDNA， 其序列如SEQ  ID NO.9所示； 和/或rs104876 67野生型crDNA， 其序列如SEQ  ID NO.10所示； 所述野生型crRNA包括： rs2267682野生型crRNA， 其序列如SEQ  ID NO.11所示； 和/或rs104876 67野生型crRNA， 其序列如SEQ  ID NO.12所示。 7.如权利要求1所述检测试剂盒在检测与脑卒中相关TBXAS1基因突变中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述应用的过程具体为： 对待测DNA样品进 行PCR扩增， 扩增完成后加入检测混合液反应， 并采集荧光变化； 所述检测混合液含有荧光 探针和权利要求1所述突变型crRNA； 所述突变型crDNA在T7  RNA聚合酶作用下生成RNA， 经 回收纯化得到对应的crRNA。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述PCR扩增的程序 为： 95℃3min进行预变 性； 95℃10s， 6 0℃20s， 循环3 0次； 最后降温至25℃， 反应结束。 10.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述检测混合液共50ul， 具体为： 250～ 500nM纯化的cas12a蛋白， 250～ 500nM突变 型crRNA， 1～5 μL荧光探针， 2 μL  DNA酶抑制剂， 无 酶水余量。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480623 A 2基于CRISPR检测脑卒中相关TBXAS1基因的试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于基因检测技术领域， 具体涉及一种基于C RISPR检测脑卒中相关TBXAS1 基因的试剂盒。 背景技术 [0002]脑卒中又称中风， 在世界范围内， 中风是致残和死亡的主要原因。 在中国， 缺血性 中风约占所有中风病例的70％， 其发病率表现出显著的地理差异， 表现为中国北方的发病 率最高， 而中国南方的发病率较低。 尽管年龄、 高血压、 糖尿病和环境因素是缺血性中风的 众所周知的危险因素， 但它 是一种多因素多基因疾病。 识别与缺血性卒中风险相关的基因 变异可以阐明卒中的发病机制， 并为预防和治疗这一复杂疾病提供新的方法。 尽管一些全 基因组关联研究评估了可能导致缺血性中风的各种多态性， 而在中国个体中， 与缺血性卒 中易感性相关的遗传变异尚未明确 确定。 [0003]血栓素A合酶1(TBXAS1)是花生四烯酸代 谢的下游酶， 是合成血栓素A2(TXA2)所必 需的酶， 现有研究认为TXA2与动脉粥样硬化病变的发展和血栓形成有关。 rs2267682和 rs10487667是TBXAS1基因的两种内含子 单核苷酸多态性(SNP)变异， 可能影响TBXAS1  mRNA 的结构和稳定性， 从而影 响TXA2的代谢物生 成； 同时研究表明rs2267682TBXAS1多态性与缺 血性卒中相关。 [0004]现阶段临床一般通过定量即时聚合酶链锁反应(Quantitative  real time  polymerase  chain reaction， Q ‑PCR)、 非放射性原位杂交技术(fluorescence  in  situhybridization， Fish)、 多重引物PCR(multiplex  PCR)等方式对患者进行基因突变检 测， 荧光检测具有灵敏度高， 选择性好等优点， 在生物检测与生化分析中起着不可替代的作 用。 然而这些检测技术存在检测时间长、 过程复杂或检测成本过高等问题， 导致无法应用到 大规模的临床样 本研究中。 因此亟需提供一种温度控制简单， 且灵敏度、 特异 性高的特异 性 片段检测方法。 [0005]RNA引导的成簇规则间隔短回文重复序列 ‑CRISPR(CRISPR ‑Cas)相关方法 由于其 高可靠性和特异 性而在快速核酸检测方面显示出相当大的前景。 目前已经开 发了几种类型 的Cas核酸酶用于CRISPR ‑Cas系统， 例如Cas9、 Cas12等， 已显示出快速、 灵敏和特异性检测 核酸的强大实用潜力。 发明内容 [0006]有鉴于此， 本发明的目的在于解决现有技术中检测时间长、 成本过高和准确性不 高以致无法大规模应用的问题， 提供了一种基于CRISPR技术检测与脑 卒中相关的TBXAS1基 因是否存在rs2267682和/或rs10487667目标突变位点和检测该靶核酸在目标区域是否存 在突变的方法和试剂盒。 [0007]为了实现上述目的， 本发明具体采用以下技 术方案： [0008]一种检测试剂盒， 所述检测试剂盒包括 突变型crDNA或突变型crRNA；说　明　书 1/8 页 3 CN 114480623 A 3