(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210128252.7 (22)申请日 2022.02.10 (71)申请人 江苏博嘉 生物医学 科技有限公司 地址 226000 江苏省南 通市崇川区观音山 街道新胜路158号迈普科技园1幢202 室 (72)发明人 肖以磊　于福华　孙汉宇　刘岳飞　 周杰　邢晓辉　李中辰　程诚　 姚杰　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 姜婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 基于CRISPR检测脑卒中相关TYMS基因的试 剂盒 (57)摘要 本发明属于基因突变检测技术领域， 公开了 基于CRISPR检测脑卒中相关TYMS基因的试剂盒， 所述试剂盒包括针对TYMS基因rs699517和 rs2790位点设计的突变 型crDNA或突变 型crRNA， 其序列如SEQ  ID NO.1～4所示， 结合CRISPR ‑ cas12a系统， 能确定待测样本中是否存在TYMS基 因rs699517和/或rs2790位点的基因突变， 具备 特异性强、 准确性高、 检测速度快等优点， 应用前 景广阔。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图1页 CN 114438192 A 2022.05.06 CN 114438192 A 1.一种检测试剂盒， 其特 征在于， 所述检测试剂盒包括 突变型crDNA或突变型crRNA； 所述突变型crDNA包括： rs699517突变型crDNA， 其序列如SEQ  ID NO.1所示； 和/或rs2790突变型crDNA， 其序列如SEQ  ID NO.2所示； 所述突变型crRNA包括： rs699517突变型crRNA， 其序列如SEQ  ID NO.3所示； 和/或rs2790突变型crRNA， 其序列如SEQ  ID NO.4所示。 2.根据权利要求1所述的检测试剂 盒， 其特征在于， 所述检测试剂 盒包括用于特异性扩 增TYMS基因上rs699 517位点的引物对： rs699 517‑F， 其序列如SEQ  ID NO.5所示， rs699 517‑ R， 其序列如SEQ  ID NO.6所示； 和/或用 于特异性扩增TYMS基因上rs2790位点的引物对： rs2790‑F， 其序列如SEQ  ID NO.7所示； rs2790 ‑R， 其序列如SEQ  ID NO.8所示。 3.根据权利要求1所述的检测试剂盒， 其特 征在于， 所述检测试剂盒包括cas12a 蛋白。 4.根据权利要求1所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒包括荧光探针， 所 述荧光探针的5 ’端标记有荧 光报告基团， 所述 荧光探针的3 ’端标记有荧 光猝灭基团。 5.根据权利要求1所述的检测试剂盒， 其特 征在于， 所述检测试剂盒包括DNA酶抑制剂。 6.根据权利要求1所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒中包括阴性对照 品， 所述阴性对照品为野生型crDNA或野生型crRNA： 所述野生型crDNA包括： rs699517野生型crDNA， 其序列如SEQ  ID NO.9所示； 和/或rs2790野生型crDNA， 其序列如SEQ  ID NO.10所示； 所述野生型crRNA包括： rs699517野生型crRNA， 其序列如SEQ  ID NO.11所示； 和/或rs2790野生型crRNA， 其序列如SEQ  ID NO.12所示。 7.如权利要求1所述检测试剂盒在检测与脑卒中相关TY MS基因突变中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述应用的过程具体为： 对待测DNA样品进 行PCR扩增， 扩增完成后加入检测混合液反应， 并采集荧光变化； 所述检测混合液含有荧光 探针和权利要求1所述突变型crRNA； 所述突变型crDNA在T7  RNA聚合酶作用下生成RNA， 经 回收纯化得到对应的crRNA。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述PCR扩增的程序 为： 95℃3min进行预变 性； 95℃10s， 6 0℃20s， 循环3 0次； 最后降温至25℃， 反应结束。 10.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述检测混合液共50uL， 具体为： 250～ 500nM纯化的cas12a蛋白， 250～ 500nM突变 型crRNA， 1～5 μL荧光探针， 2 μL  DNA酶抑制剂， 无 酶水余量。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438192 A 2基于CRISPR检测脑卒中相关T YMS基因的试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于基因突变检测技术领域， 具体涉及一种基于CRISPR检测脑卒中相关 TYMS基因突变的试剂盒。 背景技术 [0002]脑卒中又称中风， 是一种复杂的多因素多基因疾病， 由多种基因 ‑基因和基因 ‑环 境相互作用引起。 多种因素包括高血压、 糖尿病、 吸烟、 高脂血症和高同型半胱氨酸血症， 都 与较高的中风风险相关。 特别是高同型半胱氨酸血症， 被认为是多民族缺血性中风的一个 独立的、 潜在的可改变的危险因素。 研究表明， 高血压、 空腹血糖受损和高同型半胱氨酸血 症被认为是脑血管疾病的独立危险因素， 而这种风险的分子基础归因于叶酸循环、 蛋氨酸 循环和胸苷酸合成酶(DNA修复)中因子的异常功能， 这些因子参与单碳代谢。 例如， 同型半 胱氨酸(Hcy)和亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)直接参与蛋氨 酸的合成， 并导致与高同型半 胱氨酸血症相关的脑血 管疾病风险。 [0003]最近， 有研究调查了叶酸与中风的关系， 在随机对照试验中， 叶酸摄入有助于预防 中风。 因此， 脑血管疾病的风险受Hcy和叶酸的影响， 叶酸是预防血管疾病的候选营养素。 胸 苷酸合成酶(t hymidylate  synthetase， TYMS)是参与叶酸代谢的酶之一。 具体而言， TYMS分 别催化5,10 ‑亚甲基四氢叶酸(THF)和 脱氧尿苷单磷酸(dUMP)转化为5 ‑甲基THF‑脱氧胸苷 单磷酸(dTMP)。 这种转化需要5,10 ‑甲基THFA作为底物来生成胸苷(dTMP)， 这是DNA合成和 修复所需的核苷酸。 因此， TYMS在叶酸代谢中起着至关重要的作用， 而叶酸代谢是DNA合成 和修复的关键组成部 分。 编码这些因子的基因异常可导致多种问题， 包括MTHFR降低和胸苷 酸合成酶(TS)水平升高， 这可能通过同型半胱氨酸积累、 叶酸缺乏或两者兼而有之导致心 血管疾病。 [0004]由于TYMS参与DNA修复机制， TYMS基因的遗传变异已在癌症治疗学中被报道和研 究。 此外， TYMS基因多态性已在血管疾病中进行了研 究， 并显示与疾病 风险相关。 并且TYMS 基因多态性对缺血性卒中和SBI易感性及进展的影响也已被研究。 研究表明TYMS多态性 (1100T>C[rs699517]、 1170A>G[rs2790]])与缺血性中风和无症状性脑梗塞(SBI)的相关 性。 [0005]现阶段临床一般通过定量即时聚合酶链锁反应(Quantitative  real time  polymerase  chain reaction， Q ‑PCR)、 非放射性原位杂交技术(fluorescence  in  situhybridization， Fish)、 多重引物PCR(multiplex  PCR)等方式对患者进行基因突变检 测， 然而这些检测技术均存在检测时间长过程复杂或检测成本过高等问题， 导致无法应用 到大规模的临床样本研究中。 因此亟需提供一种温度控制简单， 且灵敏度、 特异 性高的特异 性片段检测方法。 [0006]RNA引导的成簇规则间隔短回文重复序列 ‑CRISPR(CRISPR ‑Cas)相关方法 由于其 高可靠性和特异 性而在快速核酸检测方面显示出相当大的前景。 目前已经开 发了几种类型 的Cas核酸酶用于 CRISPR‑Cas系统， 例如Cas9、 Cas12等。说　明　书 1/7 页 3 CN 114438192 A 3