(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210124318.5 (22)申请日 2022.02.10 (71)申请人 国科宁波生命与健康产业研究院 地址 315016 浙江省宁波市北郊路159号 申请人 中国科学院大学宁波华美医院 (72)发明人 毛瑞　赵月　蔡挺　 (74)专利代理 机构 上海硕力知识产权代理事务 所(普通合伙) 31251 代理人 王法男 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测猪圆环病毒II型的CDA引物对、 试 剂盒及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种基于闭合颈环介导的核酸 恒温扩增技术(Closed  Dumbbell  mediated   Isothermal  Amplification  ofnucleic acids， CDA)的引物对用于猪圆环病毒II型的快速检测。 本发明公开了一种检测猪圆环病毒II型的CDA引 物对、 试剂盒及其应用。 所述CDA引物对为针对猪 圆环病毒II型的保守区片段扩增的引物， 为 PCV2‑MF/PCV2‑MR； 其中， PCV2 ‑MF的核苷酸序列 如SEQ ID NO.1所示， PCV2 ‑MR的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示。 本发明提供的方法无需昂贵 的仪器、 也无需复杂的操作即可完成对猪圆环病 毒II型的快速准确检测， 因此， 适用于专业程度 不高的海关、 养殖场等 地的现场快速 检测。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 114381554 A 2022.04.22 CN 114381554 A 1.一种非疾病诊断目的的检测猪圆环病毒II型的CDA引物对， 其特征在于： 所述CDA引 物对为PCV2 ‑MF/PCV2‑MR， 其中， PCV2 ‑MF的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， PCV2 ‑MR的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.一种检测猪圆环病毒II型的试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒包括权利要求1所述的 CDA引物对。 3.如权利要求2所述的一种检测猪圆环病毒II型的试剂盒， 其特征在于： 所述CDA引物 对中， 引物PCV 2‑MF与PCV2‑MR的浓度均为1～ 2 μM。 4.如权利要求2所述的一种检测猪圆环病毒II型的试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒还 包括Bst聚合酶、 CDA反应缓冲液、 超纯 水以及显色剂。 5.如权利要求4所述的一种检测猪圆环病毒II型的试剂 盒， 其特征在于： 所述显色剂选 自SYBR green I、 Eva green、 羟基萘酚蓝、 铬黑T中的一种。 6.如权利要求4所述的一种检测猪圆环病毒II型的试剂盒， 其特征在于： 所述CDA反应 缓冲液包括： Tris ‑HCl、 KCl、 (NH4)2SO4、 MgSO4和Triton X‑100。 7.如权利要求2所述的一种检测猪圆环病毒II型的试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒反 应体系的组成为： 2‑50mM Tris‑HCl pH8.8 2‑20mM KCl 2‑20mM(NH4)2SO4 2～20mM MgSO4 0.1～0.5％Trito nX‑100 0.2～1M甜菜碱 1～1.6mM  dNTP 5～10U Bst DNA聚合酶 100～150 μmol/L显色剂 1～2 μM引物PCV 2‑MF 1～2 μM引物PCV 2‑MR； 反应溶剂为超纯 水。 8.权利要求7所述的试剂盒非疾病诊断目的的检测猪圆环病毒II型的方法， 包括以下 步骤： 步骤1： 将待检测核酸样本和试剂盒的反应 体系混合， 制备扩增反应液； 步骤2： 上述制备得到的扩增反应液， 于60～65℃反应20～80min， 根据显色结果判断样 品中是否含有猪圆环病毒I I型。 9.权利要求1所述的CDA引物对在非疾病诊断目的 的猪圆环病毒I I型检测中的应用。 10.权利要求2 ‑7任一项所述的试剂盒在非疾病诊断目的的猪圆环病毒II型检测中的 应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114381554 A 2一种检测猪圆环病毒I I型的CDA引物对、 试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一种检测猪圆环病毒II型的CDA引物对、 试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]猪圆环病毒II型(PCV2)感染为二类传染病、 是猪的一种常发病毒性感染疾病， 由 猪圆环病毒引起的猪的一种新的传染病。 本病 可导致猪群产生严重的免疫抑制， 从而容易 导致继发或并发其他传染病。 猪圆环病毒2型 的危害在于能够使感染猪只的免疫功 能受到 损害， 这种 可导致机体免疫抑制的病毒， 由于经常以亚临床感染的形式出现， 常易被忽视。 为了更好 地控制猪圆环病毒的感染， 迫切需要寻找一种适 合的快速准确的诊断方法。 [0003]目前对于PCV2的免疫学诊断方法的研究较少， 难于适用PCV2的早期疫情防控。 在 分子生物学检测技术中， 经典的P CR技术在各种病原检测中得到了广泛的运用。 现有的检测 方法主要包括PCR、 DNA探针技术等。 尽管这些技术能快速检测样品中总的或致病 性猪圆环 病毒II型的数量， 但这些方法依赖于特殊而 昂贵的设备， 且其操作过程复杂费时(包括DNA 的分离、 杂交、 比色以及探针和引物的合成等)， 只有熟练掌握其操作技巧的技术人员才能 完成测试。 因此， 以上针对核酸分子的方法并不适用于现场快速检测， 建立一种快速、 灵敏、 特异的猪圆环病毒I I型核酸检测方法迫在眉睫。 [0004]基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(Closed  Dumbbell  mediated   Isothermal Amplification  ofnucleic  acids， CDA)是国科宁波 生命与健康产业研究院开 发的替代日本LAMP核酸扩增的方法(中国发明专利号： ZL202110473121.8)。 该方法主要利 用2种不同的特异 性引物识别靶基因的特定区域， 在恒温条件进 行扩增反应。 与常规基因检 测手段(如PCR等)相比， CDA反应在恒温水浴箱中便可完成， 仪器设备要求低， 较传统PCR和 培养法操作简单许多， 不需要专业人士也可准确完成， 且扩增结果可结合金属离子指示剂 羟基萘酚兰(HNB)， 通过肉 眼观察颜色变化以实现对结果的判断， 使其适用于基层医疗机构 及地方检验检疫部门。 并且， CDA还 可以大大缩短操作时间， 减少样品污染机会， 适合应用于 猪圆环病毒II型的快速诊断。 此外， CDA所用关键成环引物约为30bp， 较LAMP中成环引物 40bp短， 这将极大程度的节约成本 。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种检测猪圆环病毒I I型的CDA引物对、 试剂盒及其应用。 [0006]本发明为实现上述目的所采用的技 术方案如下： [0007]一种非疾病诊断目的的检测猪圆环病毒II型的CDA引物对， 所述CDA引物对为 PCV2‑MF/PCV2‑MR， 其中， PCV2 ‑MF的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， PCV2 ‑MR的核苷酸序列 如SEQ ID NO.2所示。 [0008]本发明还提供一种检测猪圆环病毒II型的试剂盒， 所述试剂盒包括上述的CDA引 物对。说　明　书 1/5 页 3 CN 114381554 A 3