(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210127758.6 (22)申请日 2022.02.11 (71)申请人 南京中医药大学 地址 210023 江苏省南京市栖霞区仙林大 道138号 (72)发明人 陆兔林　赵晓莉　毛春芹　毛靖　 许金国　苏雪蓉　谢颖　娄悦　 (74)专利代理 机构 江苏致邦律师事务所 32 230 专利代理师 尹妍　徐蓓 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 用于鉴定炮制辅料鳖血的特异性引物对、 试 剂盒及应用 (57)摘要 本发明涉及用 于鉴定炮制辅料鳖血的特异 性引物对、 试剂盒及应用， 该特异性引物对由正 向引物和反向引物组成， 其正向引物核苷酸序列 为： CTAGCAACCTAGCCCATGTG； 反向引物核苷酸序 列为： GGATCTCCTCCTCCAGAAGG。 本发明还提供前 述特异性引物对在鳖血鉴定中的应用。 本发明的 特异性引物对 特异性好， 只需要在一个 反应体系 内进行聚合酶链式反应 （PCR） 扩增反应， 仅1  h即 能快速、 准确鉴定炮制辅料鳖血和其他动物血 液， 并能实现鳖血与其他动物的鉴别， 为鳖血提 供完善、 客观、 稳定、 准确、 科 学可靠的鉴定方法。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图3页 CN 114672571 A 2022.06.28 CN 114672571 A 1.一种用于鉴定 炮制辅料 鳖血的特异性引物对， 其特 征在于， 正向引物核苷酸序列为： CTAGCA ACCTAGCCCATGTG； 反向引物核苷酸序列为： G GATCTCCTCCTCCAGAAGG。 2.权利要求1所述特异性引物对在制备用于鉴定 炮制辅料 鳖血的试剂盒中的应用。 3.一种用于鉴定炮制辅料鳖血的试剂 盒， 其特征在于， 包含权利要求1所述特异性引物 对。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特 征在于， 还 包括PCR反应的试剂。 5.权利要求1所述特异性引物对在炮制辅料 鳖血鉴定中的应用。 6. 根据权利 要求5所述的应用， 其特征在于， 包括： 提取待鉴定样品基因组DNA， 以提取 的基因组DNA为模板， 使用所述特异性引物进行PCR扩增， 对PCR扩增产物进行电泳检测， 在 286 bp处检测出条带的样品鉴定为鳖血， 在28 6 bp处未检测出条带的样品鉴定为其他动物 血液。 7.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 包括， 提取待鉴定样品基因组DNA， 以提取 的基因组DNA为模板， 使用所述特异性引物进行PCR扩增， 对PCR扩增产物进行测序， 根据测 序结果进行基原鉴定 。 8.根据权利要求6或7 所述的应用， 其特 征在于， PCR扩增的反应 体系如下： 基因组DNA提取物10 0 ng； 2×Rapid Taq Master Mix 5 μL； 正向引物和反向引物各  (10 μM) 0.2 μL； 双蒸水补足至10  μL。 9. 根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， PCR扩增的扩增程序为： 95℃预变性3   min， 95℃变性15  sec， 62℃ 退火15 sec， 72℃延伸15  sec， 进行29次扩增循环， 72℃彻底延 伸3 min。 10.根据权利要求3或4所述的应用， 其特征在于， 还包括， 在利用特异性引物对对待测 样品进行基因水平的鉴定后， 基于十二烷基硫酸钠 ‑聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS ‑PAGE） 方法 对待测样品进行蛋白水平的鉴定 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114672571 A 2用于鉴定炮制辅料鳖血的特异性引物对、 试剂盒及应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物制品鉴定及分子标记技术领域， 尤其涉及用于鉴定炮制辅料鳖血 的特异性引物对、 试剂盒及应用。 背景技术 [0002]鳖血系鳖科动物 中华鳖(Trionyx  sinensis  Wiegmann)的新鲜血液， 由于鳖血具 有滋阴清热、 活血通络的功效， 因此被广泛记载并应用于中 国传统医药中。 通过对历代本草 典籍的考证发现， 鳖血除直接药用之外， 还是一种具有中药传统特色的炮制辅料， 用以填血 滋阴， 抑制药物 浮阳之性， 增强清肝退热之效， 主要用于炮制柴胡、 胡黄连、 黄连、 青蒿、 甘 草 节等饮片， 并应用于方剂中， 其中鳖血柴胡饮片作为江西樟帮特色炮制方法沿用至今。 据文 献记载， 每100kg柴胡药材炮制需要活鳖200个， 即近6L鳖血。 鳖血药效显著但量少难取， 目 前鳖血作为中药炮制辅料的质量标准尚缺乏专属性鉴别， 而 血液类药材存在以猪血牛血等 量大易得动物血液掺伪现象， 并且不同种属动物血液仅从形态上难以区分。 炮制 辅料鳖血 基原无从保证， 直接影响用其作为辅料炮制的中药饮片的质量及其临床用药的安全性和有 效性， 因此急需一系列 专属性强、 科学可靠的检测鳖血辅料的方法。 传统的性状鉴定方法易 受采集加工、 储存等因素影响， 性状差异较大， 主观性较强； 使用单一成分鉴定具有局限性， 同时近缘物种的化学成分差异较小， 不 易直接观察。 [0003]特异性PCR鉴别技术基于物种DNA序列， 通过设计具有物种特异性 的引物， 进行聚 合酶链式反应扩增出目标条带从而进 行物种鉴别， 具有分析速度快、 结果准确的优点。 目前 聚合酶链 式反应法(PCR)已经纳入2020版 《中国药典》 ， 而目前对炮制辅料鳖血完整的科学 鉴定方法， 特别在炮制辅料鳖血的分子生物学、 生物化学方面的特征性鉴定尚无依据可询， 因此用高科技建立鳖血产品的分子生物学、 生物化学方面的特征性鉴定手段， 成为当前紧 要任务。 [0004]十二烷基硫酸钠 ‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS ‑PAGE)是根据样品中蛋白质分子量大 小的不同， 使其在电泳胶中分离。 经文献查证和试验研究， 不同种属样品在蛋白条带数目、 大小上均不相同， 同种属样品在蛋白条带数目、 大小 上保持一致， 可有效鉴别炮制辅料鳖血 质量。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供用于鉴定炮制辅料鳖血的特异性引物对及其应用， 为辅料 鳖血的真伪提供 科学可靠的鉴定方法。 [0006]为实现上述 技术目的， 本发明采用如下技 术方案： [0007]一种用于鉴定 炮制辅料 鳖血的特异性引物对， [0008]正向引物核苷酸序列为： CTAGCA ACCTAGCCCATGTG； [0009]反向引物核苷酸序列为： G GATCTCCTCCTCCAGAAGG。 [0010]本发明的另一目的在于提供上述特异性引物对在制备用于鉴定炮制辅料鳖血的说　明　书 1/7 页 3 CN 114672571 A 3