(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210129994.1 (22)申请日 2022.02.11 (71)申请人 重庆巴斯德生物医药 科技有限公司 地址 400700 重庆市北碚区京东方大道3 04 号 (72)发明人 张祥林　张劲松　侯艳雯　魏鹏　 胡秋萍　 (74)专利代理 机构 上海光华专利事务所(普通 合伙) 31219 代理人 王秋霞　许亦琳 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种联合检测多种呼吸道病毒的PCR引物组 及试剂盒 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 特别是涉及一种 联合检测多种呼吸道病毒的PCR引物组及试剂 盒， 所述PCR引物组包括甲型流感病毒检测引物 对、 甲型流感病毒H1N1检测引物对、 甲型流感病 毒H3N2检测引物对、 乙型流感病毒检测引物对、 人呼吸道 合胞病毒检测引物对、 人偏肺病毒检测 引物对、 鼻病毒/肠道病毒检测引物对。 所述试剂 盒中包括多重RT ‑PCR反应物， 所述多重RT ‑PCR反 应物中包括所述PCR引物组。 本发明的引物组和 试剂盒可以联合检测并鉴定七种呼吸道病毒， 该 方法操作简单、 检测准确、 灵敏高， 特异性高， 显 著缩短检测时间， 可以实现2 ‑3小时内可出检测 结果。 权利要求书1页 说明书16页 序列表10页 附图8页 CN 114262759 A 2022.04.01 CN 114262759 A 1.一种联合检测多种呼吸道病毒的PCR引物组， 其特征在于， 所述PCR引物组包括甲型 流感病毒检测引物对、 甲型流 感病毒H1N1检测引物对、 甲型流 感病毒H3N2检测引物对、 乙型 流感病毒检测引物对、 人呼吸道合胞病毒检测引物对、 人偏肺病毒检测引物对、 鼻病毒和肠 道病毒检测引物对。 2.根据权利要求1所述的PCR引物组， 其特 征在于， 所述引物组还 包括以下 特征： 1)甲型流感病毒检测引 物对： 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示的上游引 物和核苷 酸序列如SEQ  ID NO.2所示的下游引物； 2)甲型流感病毒H1N1检测引物对： 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示的上游引物和 核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示的下游引物； 3)甲型流感病毒H3N2检测引物对： 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示的上游引物和 核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示的下游引物； 4)乙型流感病毒检测引 物对： 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.7所示的上游引 物和核苷 酸序列如SEQ  ID NO.8所示的下游引物； 5)人呼吸道合胞病毒检测引 物对： 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.9所示的上游引 物和 核苷酸序列如SEQ  ID NO.10所示的下游引物； 6)人偏肺病毒检测引物对： 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.11所示的上游引物和核苷酸 序列如SEQ  ID NO.12所示的下游引物； 7)鼻病毒和肠道病毒检测引物对： 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.13所示的上游引物和 核苷酸序列如SEQ  ID NO.14所示的下游引物。 3.权利要求1或2所述的PCR引物组在制备检测甲型流感病毒、 甲型流感病毒H1N1、 甲型 流感病毒H3N2、 乙型流感病毒、 人呼吸道合胞病毒、 人偏肺病毒、 鼻病毒和肠道病毒的试剂 盒中的用途。 4.一种联合检测甲型流感病毒、 甲型流感病毒H1N1、 甲型流感病毒H3N2、 乙型流感病 毒、 人呼吸道合胞病毒、 人偏肺病毒、 鼻病毒和肠道病毒的试剂盒， 所述试剂盒中包括多重 RT‑PCR反应物， 所述多重RT ‑PCR反应物中包括权利要求1或2所述的PCR引物组。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述多重RT ‑PCR反应物中还包括 OneStep RT‑PCR Enzyme MIX和/或外源RNA内参扩增引物对。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述外源RNA内参扩增引物对包括核苷 酸序列如SEQ  ID NO.15所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ  ID NO.16所示的下游引物。 7.根据权利 要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 以所述多重RT ‑PCR反应物的总体积为基 准， 所述多重RT ‑PCR反应物中每条引物的浓度为5 0nmol/L～600nmol/L。 8.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中还包括样品RNA提取试剂、 阳性质控品、 阴性质控品中的任一项或多 项。 9.根据权利要求8所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述阳性质控 品为含各目标病 毒特异核 酸片段和外源RNA内参特异核酸片段的质粒DNA， 和/或， 所述阴性质控品为TE缓冲液。 10.根据权利要求9所述的试剂盒， 其特征在于， 所述阳性质控 品各质粒DNA的核苷酸序 列如SEQ ID NO.17～24所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114262759 A 2一种联合检测多种呼吸道病毒 的PCR引物组及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 特别是涉及一种联合检测多种呼吸道病毒的PCR引物 组及试剂盒。 背景技术 [0002]呼吸道感染的发病率、 死亡率、 住院率和医疗负担均较高， 呼吸道病毒如流感病毒 和人呼吸道合胞病毒主要原因， 特别是在幼儿、 孕妇、 老年人和其他合并症患者中。 流感病 毒和人呼吸道合胞病毒也是获得性肺炎的主要病原体。 除流感病毒和人呼吸道合胞病毒 外， 临床常见的可导致呼吸道感染的病毒还包括人偏肺病毒、 鼻病毒、 副流感病毒、 冠状病 毒、 腺病毒、 博卡病毒等。 [0003]目前常用的呼吸道病毒检测方法主要包括以下： 病毒分离培养、 病毒抗原检测、 病 毒抗体检测、 病毒直接检测、 病毒核酸检测方法等。 呼吸道病毒分离培养目前仍然 是病毒诊 断的金标准。 然而该方法存在以下缺点： (1)操作复杂繁琐， 不易标准化； (2)培养周 期长； (3)检测环节较多； (4)人员技术要求较高。 病毒抗原检测特异度较好， 阳性提示活动性病毒 感染， 但灵敏度较低， 常有假阴性。 病毒抗体检测是利用抗原与抗体的特异 性反应原理进 行 检测， 该方法灵敏性低， 仅反映人体免疫反应情况， 而不能反映患者真实感染情况， 仅可以 用于回顾性调查， 但对早期诊断意义不大。 病毒直接检测 通过电子显微镜直接观察呼吸道 标本中病毒的典型特征形态， 但要求标本有 大量的病毒且要求有 经验的技术人员和昂贵的 电子显微镜设备， 操作复杂， 技术要求高。 病毒核酸检测方法迅猛发展， 由于其快速、 简便、 高通量、 高敏感度及高特异度的优势， 成为诊断呼吸道病毒感染的主要 方法。 常用的检测方 法是实时荧光定量PCR法。 尽管其具有高特异性、 敏感性和时效性， 但也存在如下缺点： (1) 通量低： 受限于荧光通道， 单管仅能检测3种病毒； (2)成本高： 多种病毒同时检测， 成本较 高。 因此， 亟需开发操作简单、 准确度高、 通量高、 检测成本低， 且可以针对同一份标本检测 多种呼吸道病毒的检测技术， 实现快速准确检测呼吸道病毒， 可以大大提高检测效率、 缩短 检测周期、 降低检测成本， 具有显著的卫生经济学与社会经济学效益， 适用于临床检测、 卫 生防疫及流行病学调查 等。 发明内容 [0004]鉴于以上所述现有技术的缺点， 本发明的目的在于提供一种联合检测多种呼吸道 病毒的PCR引物组及试剂盒， 用于解决现有技 术中的问题。 [0005]为实现上述目的及其他相关目的， 本发明提供一种联合检测多种呼吸道病毒的 PCR引物组， 所述PCR引物组包括甲型流 感病毒检测引物对、 甲型流 感病毒H1N1检测引物对、 甲型流感病毒H3N2检测引物对、 乙型流 感病毒检测引物对、 人呼吸道 合胞病毒检测引物对、 人偏肺病毒检测引物对、 鼻病毒/肠道病毒检测引物对。 [0006]本发明还提供所述PC R引物组在制备检测甲型流感病毒、 甲型流感病毒H 1N1、 甲型 流感病毒H3N2、 乙型流感病毒、 人呼吸道合胞病毒、 人偏肺病毒和鼻病毒/肠道病毒的试剂说　明　书 1/16 页 3 CN 114262759 A 3