(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210128448.6 (22)申请日 2022.02.11 (71)申请人 求臻医学科技 （北京） 有限公司 地址 100000 北京市大兴区北京经济技 术 开发区经海四路15 6号3号楼1层101 (72)发明人 刘金超　王天阳　牛孝亮　段小红　 (74)专利代理 机构 重庆百润洪知识产权代理有 限公司 5 0219 专利代理师 陈付玉 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于JAK2基因突变检测的特异性探针 及检测方法 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 特别涉及一种用 于JAK2基因突变检测的特异性探针及检测方法， 特异性探针由包含两个片段的核苷 酸链组成； 第 一片段， 其全部或者一部分具有用于对靶核酸进 行分子识别的识别序列； 第二片段， 包括但不限 于C3 Spacer、 C6  Spacer、 C12  Spacer、 Spacer  9 或Spacer  18。 与现有 技术相比， 本发明提供的种 用于JAK2基因突变检测的特异性探针及检测方 法， 通过设计特异性结合野生型基因序列的探 针， 抑制野生型序列的扩增， 从而实现了对突变 型序列的选 择性扩增和富集， 可以将Sanger测序 法的测序灵敏度由目前的20％左右提升为0.5％ ～1％左右， 提高了JAK2基因突变的检出率。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 114525340 A 2022.05.24 CN 114525340 A 1.一种用于JAK2基因突变检测的特异性探针， 其特征在于： 由包含两个片段的核苷酸 链组成； 第一片段， 其全部或者 一部分具有用于对 靶核酸进行分子识别的识别序列； 第二片段， 包括但不限于 C3 Spacer、 C 6 Spacer、 C12  Spacer、 Spacer  9或Spacer  18。 其中， 所述第一片段的序列为 Seq ID NO.1： GGAGTATGTGTCTGTG GAGACG。 2.根据权利要求1所述的一种用于JAK2基因突变检测的特异性探针， 其特征在于： 所述 第一片段和第二片段通过3 ‑3’结合。 3.一种JAK2基因突变的检测方法， 其特 征在于包括以下步骤： S1.体系配置： 将提取血液样本中的基因组为模板、 PCR扩增预混液、 权利要求1所述的 特异性探针、 JAK2上游引物、 JAK2下游引物， 配置成扩增体系； S2.进行多重PCR扩增， 将扩增产物纯化； S3.将纯化产物作为模板， 加入M13R测序引物， 进行测序反应； S4.将测序 产物纯化后进行测序分析。 4.根据权利要求3所述的一种JAK2基因突变的检测方法， 其特 征在于 JAK2上游引物的序列如下： Seq ID NO.2： GCAT TTGGTTTTAAATTATGGAGT； JAK2下游引物的序列如下： Seq ID NO.3： AGGAAACAGCTATGAC CCTGACACCTAGCTGTGATC CTG； M13R测序引物的序列如下： Seq ID NO.4： CAG GAAACAGCTATGAC C。 5.根据权利 要求3所述的一种JAK2基因突变的检测方法， 其特征在于S1中的PCR扩增预 混液包括Taq  DNA聚合酶和荧 光染料。 6.根据权利 要求3所述的一种JAK2基因突变的检测方法， 其特征在于S2的扩增程序为： 95℃/10mi n； 95℃/15s， 6 0℃/20s， 72℃/ 30s， 40个循环； 72℃/ 5min。 7.根据权利 要求3所述的一种JAK2基因突变的检测方法， 其特征在于S2的纯化体系为： 取6.0 μL的PCR扩增产物、 1.0 μL的核酸外切酶ExoI、 0.2 μL的小牛肠碱性磷酸酶和2.8 μL的纯 化水， 进行PCR扩增产物的酶解纯化反应。 8.根据权利 要求3所述的一种JAK2基因突变的检测方法， 其特征在于S2的纯化程序为： 37℃/60min； 80℃/15mi n； 25℃/1mi n。 9.根据权利要求3所述的一种JAK2基因突变的检测方法， 其特征在于S3的测序反应程 序为： 37℃/10min； 9 6℃/1min； 9 6℃/10s， 50℃/5s， 60℃/2min， 35个循环； 60℃/2min； 2 5℃/ 1min。 10.根据权利要求3所述的一种JAK2基因突变的检测方法， 其特征在于S4的纯化条件具 体为： 将测序产物中加入16μL醋酸钠 ‑乙醇混合物， 涡旋振荡后避光静置， 于4℃下离心分 离， 弃上层液体后加入70 μL预冷的70％乙醇， 涡旋振荡后， 于4℃离心分离， 弃上层液体， 加 入甲酰胺溶解。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114525340 A 2一种用于 JAK2基因 突变检测的特异性探针及检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 特别涉及一种用于JAK2基因突变检测的特异性探针及 检测方法。 背景技术 [0002]骨髓增殖性肿瘤是一组异质性的、 来源于克隆性造血干细胞的恶性肿瘤， 以骨髓 一系或多系过度增殖为特征， 其中BCR ‑ABL1基因阴性的MPN包括真性红细胞增多症(PV)、 原 发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)等。 JAK2是一种非受体型酪氨酸激酶、 JAKs蛋白(Janus  kinases)家族成员之一， 它通过JAK ‑STAT信号通路介导细胞因子的胞内 信号转导， 在造血干细胞的增殖和分化中起了重要的作用。 研 究表明， JAK2基因V617F激活 突变存在于约97％的PV患者、 50 ‑60％的ET患者和50％的PMF患者中。 2017年WHO造血和淋巴 组织肿瘤分类(第4版)明确将JAK2基因V617F突变作为MPN中的PV、 ET和PMF的主要诊断指标 之一， 美国NC CN诊疗指南和中国专 家指南均建议采用此 标准。 [0003]以Sanger核酸测序法为代表的一代测 序测序技术已广泛应用于临床， 在多种疾病 的预防、 诊断及鉴别诊断、 预后预测、 用药指导、 疗效评价等方面 都发挥着 重要的作用。 一代 测序技术稳定、 简便、 自动化程度高、 所得数据为直接基因组序列、 数据准确、 可重复性好， 现被公认为基因检测的 “金标准”。 [0004]Sanger法又称作双脱氧链终止法， 是目前应用最多的核酸测序技术， 由S anger等 人于1977年发明提出。 目前国内外已经开发上市了多款基因分析仪。 此类基因分析仪基于 大小不同的分子在毛细管电泳中的迁移 率不同的原理， 当标记有荧光的分子逐一通过毛细 管时， 激光检测器即可对其逐个进行检测， 并同步成像， 随后分析软件自动 将不同的荧光信 号转变为核酸序列， 从而实现测序目的。 但是传统的Sanger测序法的灵敏度只有20％左右， 这极大的限制了其在临床实 践中的应用。 发明内容 [0005]针对以上述背景技术的不足， 本 发明提供一种用于JAK2基因突变检测的特异性探 针及检测方法， 解决了传统的Sanger测序法的灵敏度不高， 基因突变的检出率低的问题。 [0006]一方面， 本 发明提供一种用于JA K2基因突变检测的特异性探针， 关键在于： 由包含 两个片段的核苷酸链组成； [0007]第一片段， 其全部或者 一部分具有用于对 靶核酸进行分子识别的识别序列； [0008]第二片段， 包括但不限于C3  Spacer、 C6  Spacer、 C12  Spacer、 Spacer  9或 Spacer18。 [0009]优选的， 所述第一片段的序列为 [0010]Seq ID NO.1： GGAGTATGTGTCTGTG GAGACG。 [0011]优选的， 所述第一片段和第二片段通过3 ‑3’结合。 [0012]另一方面， 本发明提供一种JAK2基因突变的检测方法， 关键在于包括以下步骤：说　明　书 1/4 页 3 CN 114525340 A 3