(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221012831 1.0 (22)申请日 2022.02.11 (71)申请人 内蒙古农业大 学职业技术学院 地址 014109 内蒙古自治区包头市土默特 右旗110国道668公里内蒙古农业大学 职业技术学院 (72)发明人 嘎利兵嘎 　乌英嘎　 (74)专利代理 机构 北京挺立专利事务所(普通 合伙) 11265 代理人 张亚伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种快速鉴别 马属动物速度基因SNP位点基 因型的核酸检测PCR引物、 探 针及方法 (57)摘要 本发明公开了一种快速鉴别马属动物速度 基因 （MSTN） SNP位点基因型的核 酸检测PCR引物、 探针及方法。 该方法为先从马血液样品中提取基 因组DNA作为模板， 利用所设计的1对特异性引物 和探针进行PCR扩增， 并根据探针熔解温度来鉴 别马属动物速度基因 （MSTN） 基因型的核酸检测 方法。 本发明操作简单， 只需PCR反应前加入荧光 探针即可， 无需电泳， 检测速度快， 全部操作过程 只需3小时。 该方法对于快速选择和培育优质运 动马具有临床指导 意义。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 114395633 A 2022.04.26 CN 114395633 A 1.一种快速鉴别马属动物速度基因SNP位点基因型的核酸检测PCR引物， 其特征在于核 苷酸序列如下 所示： 引物Hurd ‑f： 5ˊ‑GACACAACAGTTTCAAAATATTGTTCTCCTT‑3ˊ 引物Hurd ‑r： 5ˊ‑CCAGGACTATTTGATAGCAGAGTCA ‑3ˊ。 2.一种快速鉴别马属动物速度基因SNP位点基因型的核酸检测探针， 其特征在于核苷 酸序列如下 所示： 探针P： 5ˊ‑CAGGTTATAATGCACCAAATAATTTTC‑3ˊ。 3.根据权利要求2所述的探针， 所述探针序列5 ˊ端标记的荧光基团为FAM、 HEX、 VIC、 CY5、 TET中的任意 一种， 探针序列3 ˊ端标记的淬灭基团为TAMRA、 MGB、 BHQ中的任意 一种。 4.一种快速鉴别马属动物速度基因SNP位点基因型的核酸检测方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： S01 从血液样品中提取基因 组DNA； S02 以提取的DNA为模板， 用权利要求1中所述的引物Hurd ‑f和Hurd‑r， 及权利要求2中 所述的探针p进行荧 光PCR扩增反应获得扩增产物； S03 对扩增产物进行 熔解曲线分析， 确定样品基因型， 得到马属动物的表现型。 5.根据权利要求 4所述的检测方法， 其特 征在于： 在引物Hurd ‑f、 Hurd‑r和探针P的荧光检测结果中， 若样品出现2个熔解峰则判定为杂 合基因型； 在引物Hurd ‑f、 Hurd‑r和探针P的荧光检测结果中， 若样品出现1个熔解峰， 熔解温度为 56.3±1.0℃则判定为 突变纯合型 （C /C） ； 在引物Hurd ‑f、 Hurd‑r和探针P的荧光检测结果中， 若样品出现1个熔解峰， 熔解温度为 61.7±1.0℃则判定为野生纯合型 （T/T） 。 6.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于： 步骤S02中的荧光PCR扩增反应体系 为： ddH2 O 2.5 μl Premix Ex‑Taq   5.0 μl 1 μM引物Hurd ‑f  0.5 μl 10 μM 引物Hurd ‑r  0.5 μl 10 μM 探针P   0.5 μl DNA模板    1.0 μl 总体积    10 μl。 7.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于： 步骤S02中的荧光PCR扩增反应程序 为： 95℃预变性5mi n； 95℃变性15s， 5 5℃退火15s， 72℃延伸15s； 循环5 0次。 8.根据权利 要求4所述的检测方法， 其特征在于： 步骤S03中的熔解曲线分析程序为： 95 ℃变性3min； 37℃退火3min； 43℃到75℃以0  .1℃/s的速率， 5次/℃连续采集探针P的荧光 信号， 进行 熔解曲线分析。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114395633 A 2一种快速鉴别马属动物速度基因SNP位点 基因型的核酸检测 PCR引物、 探针及方 法 技术领域 [0001]本发明涉及对马属速度基因的检测技术， 更具体 的说， 是涉及一种快速鉴别马属 动物速度基因SNP位 点基因型的核酸检测PCR引物、 探针及方法。 背景技术 [0002]国内外研究表明马属动物的运动潜能和其基因有直接相关。 马属动 物共有64条染 色体， 其中第18号染色体上的肌肉生长素抑制基因MSTN （速度基因） 和马的速度相关。 当 MSTN基因基因型 （SNP>g.66493737） 为C/C时 （突变型） ， 爆 发力强， 适合于短距离比赛； 当该 基因型为C/T时 （杂合型） ， 适合中长距离比赛； 而当MSTN基因型为T/T时 （野生型） ， 耐力较 强， 更适合于长距离比赛。 虽然国内外对马属动物运动潜能基因分子遗传标记物 （SNP） 的筛 选研究做的比较多， 但目前尚无操作简单、 成本低廉及检测通 量高的SNP基因分型 方法。 [0003]目前马属动物运动潜能基因的检测 只停留在PCR ‑RFLP方法、 Taqm an探针法、 DNA测 序法和基因芯片等方法上， 而且以上方法都存在一定的缺陷， 如： P CR‑RFLP方法虽然价格便 宜， 但易污染， 单个PCR管只能检测一个基因位点； Taqman探针法虽然特异 性高， 但对于同一 个基因位点需要设计不同的探针， 价格较贵。 DNA测序方法是基因检测的金标准， 但 耗时久， 一般需要2 4小时才能出结果。 而基因芯片技术虽然检测通量高， 但费用昂贵、 操作繁琐等缺 点。 [0004]荧光探针熔解曲线分析 （fluorescence  melting curve analysis， 简称FMCA） 技 术是利用探针近似分子信标的空间二级结构特点， 通过其探针的熔解曲线 特征来分析不同 SNP位点的一种新型基因分型技术。 FMCA技术颠覆了传统探针无法做熔解曲线分析的观点， 可在单个PCR管内同时进行多个SNP位 点的检测。 [0005]目前在马属动 物基因研究领域尚无有关FMCA方法的研究报道。 基于分子信标荧光 探针的FMCA方法成本低廉， SNP位点检测通量高， 具备其它方法所没有的诸多技术优点， 可 应用于快速 选择和培 育优质运动马的分子 育种研究工作。 发明内容 [0006]有鉴于此， 为解决上述技术问题， 本发明建立了一种快速鉴别马属动物速度基因 SNP位点基因型的核酸检测PCR引物、 探针及方法。 该方法操作简易、 快速、 检测结果可靠且 检测成本低廉， 有利于在临床实 践中推广应用。 [0007] 第一方面， 本发明提供了一种快速鉴别马属动 物速度基因SNP位点基因型的核酸 检测PCR引物对， 该引物对具有两组， 分别为： 引物Hurd ‑f： 5ˊ‑GACACAACAGTTTCAAAATATTGTTCTCCTT‑3ˊ（SEQ ID NO： 1） 引物Hurd ‑r： 5ˊ‑CCAGGACTATTTGATAGCAGAGTCA ‑3ˊ（SEQ ID NO： 2） 第二方面， 本发明提供了一种快速鉴别马属动物速度基因SNP位点基因型的核酸 检测探针， 将该探针定义 为p：说　明　书 1/4 页 3 CN 114395633 A 3