(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210127555.7 (22)申请日 2022.02.11 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114262750 A (43)申请公布日 2022.04.01 (73)专利权人 中国农业科 学院蔬菜花 卉研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号中国农业科学院蔬菜花卉研究所 综合楼 (72)发明人 王晓武　常立春　章力　武剑　 梁建丽　 (74)专利代理 机构 北京北汇律师事务所 1 1711 专利代理师 李英杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01)C12N 15/11(2006.01) A01H 1/04(2006.01) (56)对比文件 CN 111450173 A,2020.07.28 US 2005085463 A1,2005.04.21 CN 104531477 A,2015.04.2 2 CN 110453003 A,2019.1 1.15 CN 110438252 A,2019.1 1.12 审查员 陈小燕 (54)发明名称 用于检测芥菜裂叶基因连锁的KASP标记的 核酸及其应用 (57)摘要 本发明公开用 于检测芥菜裂叶基因连锁的 KASP标记的核 酸及其应用。 其中该核酸包含用于 检测由多个SNP位点组成的位点集的信息， 该位 点集选自由A10_18183785、 A10_18413471、 A10_ 18876551、 A10_18911257、 A10_18930496、 A10_ 18933850、 A10_18962956、 A10_19028312、 A10_ 19184970和A10_19577069组成的组中至少两个 位点。 本发明的KASP标记具有良好的多态性， 通 过PCR和荧光检测等方法能够实现快速、 有效的 检测， 避免了繁琐的实验步骤， 从而提高检测 效 率， 显著降低检测成本， 在分子标记辅助育种中 具有广阔的应用前 景。 权利要求书1页 说明书8页 序列表5页 附图4页 CN 114262750 B 2022.09.30 CN 114262750 B 1.检测芥菜裂叶基因连锁的KASP标记的引物 组在鉴定芥菜叶片性状 中的应用， 其特征 在于， 所述引物组的引物序列如SEQ  ID NO： 16‑21所示， 所述应用包括以下步骤： (1) 提取待测芥菜的基因 组DNA； (2) 以步骤(1)中的DNA为模板， 加入特异的KAS P引物， 进行PCR扩增； (3) 对PCR产物进行荧光检测， 根据不同的荧光信号获得芥菜的不同基因型， 根据基因 型确定芥菜叶片为锯齿叶、 半深裂叶或深裂叶； 其中， 所述芥菜为F1杂合群 体20JZH0073自交产生的子代芥菜。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 步骤(2)包括构建含缓冲液和溶解于所述 缓冲液的多个引物组的反应体系的步骤， 所述反应体系中各引物组的第一正向引物、 第二 正向引物和反向引物的终浓度分别为0.1 ‑0.5 μmol/L、 0.1‑0.5 μmol/L、 0.2‑1 μmol/L。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114262750 B 2用于检测芥菜裂叶基因连锁的KASP标记的核酸及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子标记辅助育种， 具体地涉及用于检测芥菜裂叶基因连锁的KASP标 记的核酸及其应用。 背景技术 [0002]叶用芥菜是芥菜类蔬菜的一类， 属于十字花科(Cruciferae)芸薹属( Brassica )， 可以用来鲜食或腌制加工成梅干菜， 是重要的农副产品。 叶缘出现裂刻在自然界中普遍存 在， 可作为形态标记， 对逆境的适应性较强， 也有利于合理密植。 叶用芥菜也存在叶缘裂刻 的现象， 但是， 关于 芥菜裂叶的遗传基础研究报道的较少。 [0003]KASP是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetit ive Allele Specific  PCR)的缩写， 可在广泛的基因组DNA样品中， 对SNPs进行精 准的双等位基因判断。 KASP技术比传统的分子 标记检测技术更具有高效和灵活的特点(Alvarez ‑Fernandez  et al., 2021)。 结合KASP技 术来进行分子标记辅助育种可以提高育种效率。 利用分子标记结合BSA ‑RNAseq的方法已经 进行了芥菜裂叶基因定位的初探。 但是， 由于RNAseq方法和参考基因组组装质量低的限制 等因素， 导致关于芥菜裂叶基因的研究较困难。 并且， 目前也没有开 发出相关的KASP标记可 以促进裂叶芥菜的育种进程(Heng  et al., 2020)。 [0004]因此， 需要进一步研究控制裂叶的基因的分子机制， 并且开发出芥菜裂叶基因紧 密连锁的KAS P分子标记， 以用于高效的辅助裂叶芥菜的育种工作。 发明内容 [0005]为解决现有技术中的技术问题， 本发明人通过深入研究， 根据裂叶的自交系 20JZS0233和锯齿叶的自交系20JZS035 1的重测序数据以及后代F2群体20JZS0771混池的测 序数据确定了与芥菜裂叶基因相关的基因， 并开 发出该基因上下游区域紧密连锁的KASP标 记。 具体地， 本发明包括以下内容。 [0006]本发明的第一方面， 提供一种用于检测芥菜裂叶基因连锁的KASP标记的核酸， 其 包含用于检测由多个SNP位点组成的位点集的信息， 其中所述位点集选自由A10_1818378 5、 A10_18413471、 A10_18876551、 A10_18911257、 A10_18930496、 A10_18933850、 A10_ 18962956、 A10_19028312、 A10_19184970和A10_1957 7069组成的组中至少两个位 点。 [0007]根据本发明所述的用于检测芥菜裂叶基因连锁的KASP标记的核酸， 优选地， 所述 位点集如表1所示。 [0008]表1： KASP标记位点的具体信息 [0009]标记名称 T84‑66‑V2染色体 物理位置 参照碱基 变异碱基 A10_18183785 AA_Chr10 17665913 T C A10_18413471 AA_Chr10 17898660 T G A10_18876551 AA_Chr10 18338865 A G A10_1891 1257 AA_Chr10 18373531 C A 说　明　书 1/8 页 3 CN 114262750 B 3