(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210129809.9 (22)申请日 2022.02.11 (71)申请人 杭州诺辉健康科技有限公司 地址 310000 浙江省杭州市滨江区长河街 道江二路40 0号2幢13层1313室 (72)发明人 李德强　张茜　陈卓君　黄龙妹　 吕宁　陈一友　 (74)专利代理 机构 北京坤瑞律师事务所 1 1494 专利代理师 封新琴 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于F12基因甲基化的肝癌早期检测 (57)摘要 一种用于肝癌早筛的核酸甲基化检测方法 以及相应的用于肝癌检测的试剂盒。 其检测的甲 基化基因包含F12(Coagulation  factor XII)基 因， 检测的样本包括组织样本和血浆样本 。 权利要求书2页 说明书17页 附图4页 CN 114438211 A 2022.05.06 CN 114438211 A 1.一种用于肝癌检测的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包含核酸甲基化检测试剂， 所 述核酸甲基化检测试剂检测的 甲基化基因包 含F12(Coa gulation factor XII)基因。 2.根据权利要求1所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述核酸甲基化检测试剂为血浆游离核 酸甲基化检测试剂， 且所述F12基因是由F12基因产生的血浆游离核酸。 3.根据权利要求1或2所述的试剂盒， 其特征在于， 在对甲基化基因进行检测之前， 将核 酸进行亚硫酸盐转 化。 4.根据权利要求1 ‑3任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述F12基因甲基化检测试剂 所检测的甲基化序列区段包含与SEQ  ID NO:4序列有至少80％， 至少85％， 至少 90％， 至少 95％， 至少96％， 至少97％， 至少98％， 至少9 9％， 至少9 9.5％， 或10 0％相同性的序列。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述F12基因甲基化检测试剂 包含至少一个正向引物， 至少一个反向引物， 和/或至少一个探针。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述至少一个探针包含选自含SEQ  ID  NO:3,13‑15任一个的探针。 7.根据权利要求5或6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述至少一个正向引物和/或至少一 个反向引物包 含选自含SEQ  ID NO:1‑2,7‑12任一个的引物。 8.根据权利要求1 ‑7任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述F12基因甲基化检测试剂 包含选自含SEQ  ID NO:7‑9任一个的正向引物， 选自含SEQ  ID NO:10‑12任一个的反向引 物， 和/或选自含SEQ  ID NO:13‑15任一个的探针。 9.根据权利要求1 ‑8任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述F12基因甲基化检测试剂 包含引物探针组合1： 含SEQ  ID NO:7的正向引物， 含SEQ  ID NO:10的反向引物， 和含SEQ  ID  NO:13的探针。 10.根据权利要求1 ‑8任一项所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述F12基因 甲基化检测试剂 包含引物探针组合2： 含SEQ  ID NO:8的正向引物， 含SEQ  ID NO:11的反向引物， 和含SEQ  ID  NO:14的探针。 11.根据权利要求1 ‑8任一项所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述F12基因 甲基化检测试剂 包含引物探针组合3： 含SEQ  ID NO:9的正向引物， 含SEQ  ID NO:12的反向引物， 和含SEQ  ID  NO:15的探针。 12.根据权利要求1 ‑7任一项所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述F12基因 甲基化检测试剂 包含引物探针组合4： 含SEQ  ID NO:1的正向引物， 含SEQ  ID NO:2的反 向引物， 和含SEQ  ID  NO:3的探针。 13.根据权利要求2 ‑12任一项所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述血浆游离核酸为血浆游 离DNA。 14.根据权利要求1 ‑13任一项所述的试剂盒， 其特 征在于， 用B2M基因作为内参基因。 15.根据权利要求1 ‑14任一项所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述 肝癌为早期肝癌。 16.根据权利要求2 ‑15任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 还包含游离核酸提取试剂， 所述游离核酸 提取试剂通过磁珠法提取并纯化血浆游离核酸。 17.一种检测肝癌的方法， 其特 征在于， 所述方法包 含对样本中F12基因甲基化的检测。 18.根据权利 要求17所述的方法， 其特征在于， 所述样本中的F12基因是由F12基因产生 的血浆游离核酸。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114438211 A 219.根据权利要求17或18所述的方法， 其特征在于， 所述方法包含在甲基化检测之前对 核酸进行亚硫酸盐转 化。 20.根据权利要求17 ‑19任一项所述的方法， 其特征在于， 所述方法检测的甲基化序列 区段包含与SEQ  ID NO:4序列有至少80％， 至少85％， 至少 90％， 至少95％， 至少96％， 至少 97％， 至少98％， 至少9 9％， 至少9 9.5％， 或10 0％相同性的序列。 21.根据权利 要求17‑20任一项所述的方法， 其特征在于， 所述F12基因甲基化检测试剂 包含至少一个正向引物， 至少一个反向引物， 和/或至少一个探针。 22.根据权利要求21所述的方法， 其特征在于， 所述至少一个探针包含选自含SEQ  ID  NO:3,13‑15任一个的探针。 23.根据权利要求21或22所述的方法， 其特征在于， 所述至少一个正向引物和/或至少 一个反向引物包 含选自含SEQ  ID NO:1‑2,7‑12任一个的引物。 24.根据权利 要求17‑23任一项所述的方法， 其特征在于， 所述对样本中F12基因甲基化 的检测包含用选自含SEQ  ID NO:7‑9任一个的正向引物， 选自含SEQ  ID NO:10‑12任一个的 反向引物， 和/或选自含SEQ  ID NO:13‑15任一个的探针进行PCR检测。 25.根据权利 要求17‑24任一项所述的方法， 其特征在于， 所述对样本中F12基因甲基化 的检测包含用引物探针组合1： 含SEQ  ID NO:7的正向引物， 含SEQ  ID NO:10的反向引物， 和 含SEQ ID NO:13的探针进行PCR检测。 26.根据权利 要求17‑24任一项所述的方法， 其特征在于， 所述对样本中F12基因甲基化 的检测包含用引物探针组合2： 含SEQ  ID NO:8的正向引物， 含SEQ  ID NO:11的反向引物， 和 含SEQ ID NO:14的探针进行PCR检测。 27.根据权利 要求17‑24任一项所述的方法， 其特征在于， 所述对样本中F12基因甲基化 的检测包含用引物探针组合3： 含SEQ  ID NO:9的正向引物， 含SEQ  ID NO:12的反向引物， 和 含SEQ ID NO:15的探针进行PCR检测。 28.根据权利 要求17‑23任一项所述的方法， 其特征在于， 所述对样本中F12基因甲基化 的检测包含用引物探针组合4： 含SEQ  ID NO:1的正向引物， 含SEQ  ID NO:2的反向引物， 和 含SEQ ID NO:3的探针进行PCR检测。 29.根据权利要求18 ‑28任一项所述的方法， 其特征在于， 所述血浆游离核酸为血浆游 离DNA。 30.根据权利要求17 ‑29任一项所述的方法， 其特 征在于， 用B2M基因作为内参基因。 31.根据权利要求17 ‑30任一项所述的方法， 其特 征在于， 所述 肝癌为早期肝癌。 32.根据权利要求17 ‑31任一项所述的方法， 其特征在于， 在甲基化检测PCR步骤后， 对 样本的Ct值进行统计。 如果Ct≤阈值， 则样 本为为肝癌阳性； 如果Ct>阈值， 则样 本为肝癌阴 性。 33.根据权利要求32所述的方法， 其特征在于， 所述样本为血浆样本， 针对引物探针组 合1， 所述阈值为34.25 ‑38.25， 优选地， 所述阈值为35.25 ‑37.25， 更优选地， 所述阈值为 36.25； 针对引物探针组合2， 所述阈值为33.14 ‑37.14， 优选地， 所述阈值为34.14 ‑36.14， 更 优选地， 所述阈值为35.14； 针对引物探针组合3， 所述阈值为34.40 ‑38.40， 优选地， 所述阈 值为35.40‑37.40， 更优选地， 所述阈值 为36.40。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114438211 A 3