(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210131469.3 (22)申请日 2022.02.14 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114182023 A (43)申请公布日 2022.03.15 (73)专利权人 首都医科 大学附属北京朝阳医院 地址 100020 北京市朝阳区工 体南路8号首 都医科大学附属北京朝阳医院 (72)发明人 李锋　贾兴元　文豪　宋凌勰　 张莹　封国生　袁海鑫　崔晓宾　 (74)专利代理 机构 北京八月瓜知识产权代理有 限公司 1 1543 专利代理师 袁晓雨 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 113981101 A,202 2.01.28 US 20172 98347 A1,2017.10.19 US 20170 09304 A1,2017.01.12 周昱霖.环状RNA Circ -Foxo3在肾细胞癌中 的表达及临床意 义. 《中国优秀硕士学位 论文全 文数据库》 .2020,全 文. Shapiro,D.N.等.Human PAX3 /forkhead transcripti on factor gene fusi on mRNA, complete cds. 《GenBan k: U02368.1》 .19 93, 审查员 毛颖 (54)发明名称 横纹肌肉瘤中F-circP3 F的检测试剂盒及方 法 (57)摘要 本发明涉及一种检测横纹肌肉瘤石蜡包埋 组织中融合基因相关环状RNA ‑‑F‑circP3F的试 剂盒， 属于生物医学检验技术领域， 包括检测横 纹肌肉瘤的分子标志物F ‑circP3F和融合基因 PAX3‑FOXO1的试剂、 引 物组合物和探针； 分子标 志物F‑circP3F的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所 示。 本发明提供了基于一步法RT ‑PCR和qRT ‑PCR 技术的检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F ‑ circP3F的试剂盒和方法， 可实现对石蜡组织中 F‑circP3F mRNA的绝对定量检测， 可操作性及重 复性强， 能够用于批量检测， 灵敏度和特异性均 较高， 有利于横纹肌肉瘤的诊断、 分型及预后评 估。 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图5页 CN 114182023 B 2022.05.31 CN 114182023 B 1.一种检测 横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F ‑circP3F的检测试剂盒， 其特征在于， 包括诊 断横纹肌肉瘤的分子标志 物F‑circP3F和融合基因PAX3 ‑FOXO1的试剂、 引物组合物和探针； 所述分子标志 物F‑circP3F的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示； 所述引物组合物包括F ‑circP3F的引物和PAX3 ‑FOXO1的引物； 所述探针包括F ‑circP3F的探针和PAX3 ‑FOXO1的探针； 所述F‑circP3F的探针和所述PAX3 ‑FOXO1的探针序列分别如SEQ  ID No.2和SEQ  ID  No.3所示； 所述F‑circP3F的引物和所述PAX3 ‑FOXO1的引物均包括 正向引物和反向引物， F‑circP3F的正向引物的序列如SEQ  ID No.4所示， F ‑circP3F的反向引物的序列如SEQ   ID No.5所示； PAX3‑FOXO1的正向引物的序列如SEQ  ID No.6所示， PAX3 ‑FOXO1的反向引物的序列如 SEQ ID No.7所示。 2.根据权利 要求1所述的检测 横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F ‑circP3F的检测试剂盒， 其 特征在于， 还包括阳性定量参考品， 所述阳性定量参考品为含有F ‑circP3F接合位点片段的 PESI‑T质粒。 3.根据权利 要求1所述的检测 横纹肌肉瘤石蜡包埋组织中F ‑circP3F的检测试剂盒， 其 特征在于， 还包括阳性对照和阴性对照， 所述阳性对照为PAX3 ‑FOXO1融合基因阳性腺泡状 横纹肌肉瘤 细胞系RH 30； 所述阴性对照为融合基因阴性的胚胎型横纹肌肉瘤 细胞系RD。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114182023 B 2横纹肌肉瘤中F ‑circP3F的检测试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 生物医学检验技术领域， 尤其是涉及 一种检测横纹肌肉瘤石蜡包埋组 织中F‑circP3F的检测试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]横纹肌肉瘤 （rhabdomyosarcoma,  RMS） 是儿童和青少年最常见的软组织恶性肿 瘤， 约占儿童所有软组织恶性肿瘤的50%。 根据临床和组织形态特征可分为胚胎性 （embryonal  RMS， ERMS） 、 腺泡状 （alveolar  RMS， ARMS） 、 梭形细胞 （spindle  cell RMS， SRMS） 和多形性 （pleomorphic  RMS， PRMS） 等四个主要类型。 它们不仅在发病年龄、 部位、 组 织形态等方面有差异， 而且在治疗、 预后上也各不相同。 [0003]迄今的研究发现， 不同亚型的RMS中存在两类不同的分子遗传学改变： 腺泡状RMS （ARMS） 存在特异性染色体易位t  (2;13) (q35;q14)、 t  (1;13) (q36;q14)及其融合基因 PAX3/7‑FOXO1、 PAX3 ‑NCOA1/2和PAX3 ‑FOXO4等； 梭形/硬化型RMS （SRMS） 中不仅存在VGLL2 ‑ NCOA2基因重排， 而且40 ‑50%有MyoD1基因突变。 融合基因PAX ‑FOXO1及其产物主要 通过阻滞 细胞周期、 抑制细胞肌分化、 增加细胞增殖侵袭迁移能力， 并增强其下游靶基因和特定 miRNA的表达， 促进ARMS的发生发展。 与融合基因阴性者相比， 融合基因阳性RMS是一种高危 性疾病， 它对化疗反应差， 易转移和复发， 总体5年存活率低于50%， 而转移或复发患者的5年 存活率低于20%， 因此， 确定有效的诊断和治疗方法， 提高生存率是急需解决的关键问题。 [0004]环状RNA （circular  RNA， circRNA） 是1976年Sanger等人首先在植物感染的类病毒 发现的闭合环状非编码RNA分子， 具有环状共价键结构， 对外切酶具有较高的耐受性。 由于 其保守性、 丰富性和特异性， cicRNA在转录后水平具有多种生物学功能并参与肿瘤发生： （1） 充当miRNA海绵； （2） 调控基因转录； （3） 与RNA结合蛋白 （RBP） 相互作用； （4） 翻译成多肽。 越来越多的证据表明， 来自融合基因反剪接的环状RNA是除融合蛋白以外参与肿瘤发生发 展的另一个途径。 因此， 检测融合基因相关环状RNA  作为分子标志物， 有利于横纹肌肉瘤的 诊断、 分型及预后评估。 [0005]在本申请 中， 申请人在运用RT ‑PCR技术扩增腺泡状RMS中融合基因PAX3 ‑FOXO1及 其相关circ  RNA时， 通过优化引物设计和线 性RNA消化， 使用发散引物(Divergent  primer) 在腺泡状RMS细胞系中扩增到一个阳性目的片段， 通过对PCR产物Sanger测序并使用NCBI数 据库进行比对证实为融合基因PAX3 ‑FOXO1相关环状RNA （Fusion  gene PAX3‑FOXO1  related circ RNA） ， 将其命名为F ‑circP3F。 由于此F ‑circP3F为国内外首次发现， 申请人 又设计引物成功扩增并经测序验证了F ‑circP3F的全长核苷酸序列； circRNA ‑seq结果再次 证实， PAX3 ‑FOXO1阳性ARMS细胞中存在相同的F ‑circP3F。 [0006]目前， 常用的检测circRNA的分子生物学方法包括Northern  blot、 RNA原位杂交 (RNAscope与BaseScope)、 circRNA测序 （circRNA ‑seq） 和逆转录 ‑聚合酶链式反应   (Reverse  Transcription ‑Polymerase  Chain Reaction， RT ‑PCR)。 Northern  blot容易出 现RNA的降解， 虽然特异性较高能够降低假阳性率， 但灵敏度要比RT ‑PCR低， 且实验试剂对说　明　书 1/11 页 3 CN 114182023 B 3