(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210131330.9 (22)申请日 2022.02.14 (71)申请人 海南省农业科 学院热带园艺研究所 地址 571199 海南省海口市流 芳路9号 (72)发明人 郑道君　戚华沙　孙秀秀　夏腾飞　 陈加利　王春梅　马光耀　 (74)专利代理 机构 北京中安信知识产权代理事 务所(普通 合伙) 11248 专利代理师 赵黎虹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 越南油茶、 香花油茶、 小果油茶、 普通油茶的 鉴定方法 (57)摘要 本 发 明 涉 及 越 南 油 茶 ( C a m e l l i a   vietnamensis)、 香花油茶(C.osmantha)、 小果油 茶(即单籽油茶， C.oleifera  var.monosperma)、 油茶(即普通油茶， C.oleifera)的鉴定方法。 该 方法包括扩增引物ycf1 ‑5， 正向序列(5' ‑3')： TGACCTCTTAACCAGTTTTTCCA； 反向序列(5' ‑3')： TGGATTATCAAGGGCATTCCGT。 用于检测SNP1、 SNP2 和InDel 1。 扩增引物ZDJ ‑190， 正向序列(5' ‑ 3')： AAAGAGCGTGGAGGTTCGAG； 反向序列(5' ‑3')： GACTGGGTGGTCGAGTCA TG， 用于检测InDel  2位点。 当经扩增产物测序后， 香花油茶种质材料引物 ycf1‑5产物列序中的SNP1和SNP2上表现为 “T”碱 基； InDel  1缺失“TCTTTT”序列者为小果油茶。 InDel 2位点表现为缺失 “AGTAC”序列者为越南 油茶， 不缺失者为普通油茶。 据此， 可有效检测鉴 定越南油 茶、 香花油 茶、 小果油 茶和普通油茶资 源， 为相关油茶资源的分类鉴定与分子育种选择提供了技 术支撑。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图3页 CN 114574614 A 2022.06.03 CN 114574614 A 1.鉴定4个油茶物种种质材料的叶绿体基因组SNP位点和InDel位点， 其特征在于， 所述 SNP位点包括SNP1和SNP2， 所述InDel位点包括InDel  1和InDel  2， SNP1和 SNP2位于ycf1基 因区， 所述 InDel 1位于ycf1基因， 所述 InDel 2位于ycf15_t rnL‑CAA基因区间序列上。 2.用于四个油茶物种鉴定的特异性引物， 其特征在于， 包括扩增引物ycf1 ‑5和扩增引 物ZDJ‑190， 所述扩增引物ycf1 ‑5用于检测SNP1、 SNP2和InDel  1， 所述扩增引物ZDJ ‑190用 于检测InDel 2； 所述ycf1 ‑5包括： 正向引物： 5'TGAC CTCTTAACCAGTTTTTCCA3' 反向引物： 5'TG GATTATCAAGGGCATTCCGT'； 所述ZDJ‑190包括： 正向引物： 5'A AAGAGCGTG GAGGTTCGAG3' 反向引物： 5'GACTG GGTGGTCGAGTCATG'。 3.鉴别或辅助鉴别四个待测油茶物种 种质的方法， 包括如下步骤： S1、 提取待测普通油茶、 小果油茶、 香 花油茶、 越南油茶种质资源的总基因 组DNA； S2、 以步骤S1提取的待测样品DNA为扩增模板， 以ycf1 ‑5引物为扩增引物进行PCR扩增； S3、 PCR扩增产物检测： PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳， 在0.5 ×TBE缓冲 液中电压100V电泳40min， 所述琼脂糖凝胶含8％Goldview核酸染料， 跑胶结果在凝胶成像 系统中拍照记录， 以100bp  DNA为Marker， 扩增产物仅1个条带， 且条带大小约为827bp， 即为 目标条带； S4、 对S3的PCR产物进行测序， 测序方法为Sanger一代常规测序， 在扩增目标片段的第 404位点和第645位点即为SNP  1和SNP 2， 如待检测种质材料在这两点上碱基均为 “T”， 其他 检测物种在SNP  1上为“C”， SNP 2上为“A”， 据此可准确鉴定该种质材料属香花油茶； 在扩增 目标片段的第715 ‑720位点即为InDel  1， 如待检测种质材料在这个位点上缺失 “TCTTTT”序 列， 据此可准确鉴定鉴定该种质材 料属小果油茶； S5、 当依据S4的检测结果排除待测种质材料不属于香花油茶和小果油茶时， 继续以步 骤S1提取的待测样品DNA为扩增模板， 以ZDJ ‑190引物为扩增引物进行PCR扩增； PCR扩增的方法与S2相同， 扩增产物仅1个条 带， 且条带大小约为520bp， 即为目标 条带； S6、 对S5中的PCR产物进行测序， 测序方法为Sanger一代常规测序， 在扩增片段的第 216‑220位点即为InDel  2位点， 该位点表现为缺失 “AGTAC”序列的待测种质材料为越南油 茶， 不缺失者为普通油茶。 4.根据权利要求3所述的鉴别或辅助鉴别多个待测油茶物种的方法， 其特征在于： 在 PCR的扩增方法中： PCR反应体系(30 μL)： ddH2O 23.0 μL， 10 ×Taq Buffe 3.0 μL(Mg2+plus)， dNTPs  Mix 0.6 μL(10mM each)， Taq  DNA Polymerase 0.6 μL(5U/ μl)， ycf1 ‑5正向引物 0.4 μL(10 μM)， ycf1 ‑ 5反向引物0.4 μL(10 μM)， 或ZDJ ‑190正向引物0.4 μL(10 μM)， ycf1 ‑5反向引物0.4 μL(10 μM)， 模板DNA 2.0 μL(20ng)； 反应扩增程序： 94℃预变性5min； 94℃变性1min， 55℃退火1min， 72℃延伸2 min， 进行40 个循环； 最后72℃延伸10mi n， 4℃保存。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574614 A 2越南油茶、 香 花油茶、 小果油茶、 普通油茶的鉴定方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学及植物分子育种技术领域领域， 具体涉及越南油茶、 香花 油茶、 小果油茶、 普通油茶的鉴定方法。 背景技术 [0002]油茶与椰子、 油橄榄、 油棕并称世界四大木本油料作物， 是中国重点发展的木本油 料作物， 是中 国大宗油料作物。 油茶的茶籽油不饱和脂肪酸含量可达90％左右， 是高级保健 食用油。 油茶目前在中国的栽培面积约7000万亩。 在中国栽培的油茶涉及到山茶科山茶属 的多个物种， 其中包括油茶组中的油茶主栽物种普通油茶、 小果油茶、 越南油茶， 以及香花 油茶油茶等。 这四个物种在形态方面存在较多的相似性， 尤其是苗期的形态辨别存在一定 的难度； 同时这四个物种种植在不同的生境中， 叶片等形态 也会发生较大的变异。 这些都给 油茶生产造成较大 的影响， 对中国油茶产业发展不利。 同时， 在油茶育种中， 往往需要对亲 本进行准确鉴定， 以及 对不同物种间的杂交后代进 行早期鉴定， 而 形态方面的相似性， 尤其 是苗期形态难于辨别， 给油茶育种工作带来了 极大的不便。 因此， 建立快速高效鉴定油茶物 种种质材料的技术或方法， 显得 尤为急迫。 发明内容 [0003]为了克服现有技术中的部分缺陷， 本发明通过对小果油茶、 普通油茶、 香花油茶， 以及越南油茶四个物种， 各一份种质进行叶绿体全基因组测序和比较分析， 筛选出可用于 鉴定这四个物种的单碱基变异位点和插入/缺失位点， 开 发SNP标记和Indel标记组合、 及检 测引物与方法。 [0004]本发明的第一个目的是提供用于鉴定4个油茶物种种质资源的叶绿体基因组SNP 位点和InDel位点。 [0005]本发明的第二个目的是提供用于鉴定4个油茶物种种质资源的特异性引 物。 通过 特异性引物扩增可检测到4个油茶物种质资源的特异叶绿体 基因组SNP位点和InDel位点。 [0006]本发明的第三个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别4个待测油茶物种 种质的方法。 [0007]为了实现上述目的， 本发明是通过以下 方案予以实现的： [0008]S1、 提取待测普通油茶、 小果油茶、 香 花油茶、 越南油茶种质资源的总基因 组DNA； [0009]S2、 以步骤S1提取 的待测样品DNA为扩增模板， 以ycf1 ‑5引物为扩增引物进行PCR 扩增； [0010]S3、 PCR扩增产物检测： PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶(含8％Goldview核酸染 料)上进行电泳， 在0.5 ×TBE缓冲液中电压100V电泳40min， 跑胶结果在凝胶成像系统中拍 照记录， 以10 0bpDNA为Marker， 扩增产物仅1个条 带， 且条带大小约为827bp， 即为目标 条带； [0011]S4、 对S3的PCR产物进行测序， 测序方法为S anger一代常规测序， 在扩增目标片段 的第404位点和第645位点即为SNP1和SNP2， 如待检测种质材料在这两点上碱基均为 “T”， 其 他检测物种在SNP1上为 “C”， SNP2上为 “A”， 据此可准确鉴定该种质材料属香花油茶； 在扩