(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210131349.3 (22)申请日 2022.02.14 (71)申请人 海南省农业科 学院热带园艺研究所 地址 571199 海南省海口市流 芳路9号 (72)发明人 郑道君　戚华沙　夏腾飞　孙秀秀　 陈加利　王春梅　马光耀　 (74)专利代理 机构 北京中安信知识产权代理事 务所(普通 合伙) 11248 专利代理师 赵黎虹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鉴别海南油茶种质的Indel标记及检测 方法 (57)摘要 本发明涉及一种鉴别海南油茶种质的Indel 标记及检测方法。 标记的引物序列为： 正向引物 (5'‑3')： GGAGTCTTGGAATCTAGGTTTGGA； 反向引物 (5'‑3')： ACAGATTCATTGAGCAGCTCT。 利用本发明 开发的叶绿体基因片段Indel特异性标记， 通过 PCR扩增及 目标产物测序， 可以实现海南岛油茶 种质资源的快速、 准确鉴别。 利用上述引物， 待测 样品若为海南岛油茶种质资源， 则在扩增的目标 片段中缺失 “GTTAAT”碱基序列， 若 为岛外油茶种 质资源， 则为存在 “GTTAAT”碱基序列。 本发明方 法操作简单， 结果准确， 具有专一性好， 灵敏度高 等优点。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图1页 CN 114574615 A 2022.06.03 CN 114574615 A 1.鉴别海南岛油茶种质资源的叶绿体基因组InDel位点， 其特征在于， 该InDel位点为 “CAATTA”碱基序列， 位于psbE与petL基因区间序列上， 位于小果油茶叶绿体基因组的 68011‑68016处位点， 所述小果油茶叶绿体基因组 的入库编 号为Banklt24608 17 Camellia  MZ189740 。 2.用于海南岛油茶种质资源鉴别的InDel特异性引物， 其特征在于， 所述特异性引物命 名为psbE ‑petL‑01， 包括： 正向引物： 5'G GAGTCTTGGAATCTAGGTTTGGA3'； 反向引物： 5'ACAGAT TCATTGAGCAGCTCT3'。 3.鉴别或辅助鉴别待测海南岛油茶种质资源的方法， 包括如下步骤： S1、 提取待测海南岛 内外油茶种质基因 组DNA； S2、 以步骤S1提取的待测样品DNA为扩增模板， 以所述特异性标记引物psbE ‑petL‑01作 为扩增引物， 进行PCR扩增； S3、 对S2的PCR目标产物进行Sanger一代常规测序。 在扩增片段第175个位点左右， 上述 所有海南岛内种质表现为缺失 “GTTAAT”碱基， 若为海南岛外的油茶种质， 则存在 “GTTAAT” 碱基。 4.根据权利要求3所述的鉴别待测海南岛油茶种质资源的方法， 其特征在于： 所述PCR 扩增步骤 包括： PCR反应体系(30 μL)： 模板DNA  20ng， dNTPs  0.20mmol/L， 序列0.13 μmol/L， Taq  DNA聚 合酶2.00U， ddH2O补至总体积3 0 μL； 反应扩增程序： 94℃预变性5min； 94℃变性1min， 60℃退火1min， 72℃延伸2 min， 进行35 个循环； 最后72℃延伸10mi n， 4℃保存； PCR扩增产物检测： PCR扩增产物在含8％Goldview核酸染料1.5％琼脂糖凝胶上进行电 泳， 在0.5 ×TBE缓冲液中电压100V电泳40min， 跑胶结果在凝胶成像系统中拍照记录， 以 100bp DNA为Marker， 扩增产物仅1个条 带， 且条带大小为290bp左右， 即为目标 条带。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574615 A 2一种鉴别海南油茶种质的Indel标记及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学及 植物分子育种技术领域领域， 具体涉及鉴别海南油茶种 质的Indel标记及检测方法。 背景技术 [0002]油茶是中国重点发展的木本油料作物， 是中国大宗油料作物。 它的茶籽油不饱和 脂肪酸含量可达90％左右， 是高级保健食用油。 油茶目前在中国的栽培面积约7000万亩。 油 茶在海南俗称“山柚”， 海南岛是中 国油茶资源分布的最南缘。 海南岛油茶资源、 茶油品质和 产业发展极具特色。 经鉴别， 海南岛油茶资源属于山茶属油茶组越南油茶的一个特殊类群。 因不同于内地的茶油品质等原因， 海南茶籽油价格为内地的3倍左右。 海南省把海南油茶作 为特色经济作物重点发展， 发展势头良好。 由于海南油茶产业良好的经济效益， 在种苗市场 有大量非本地油茶种源的种苗涌入海南。 实践证明， 这些种苗种源大部分不适应海南岛的 生长环境， 出现造林成率低、 生长 极慢、 开花结实低等问题。 同时， 即使有个别的油茶种源能 适应海南生境长生， 所产的茶籽油也不具备本地茶籽油的品质。 此外， 由于海南茶籽油价格 高， 每年有 大量的非本地茶籽进入海南充当本地茶籽用于榨油， 掺合入本地茶籽油， 影响本 地茶籽油的品质。 这些极不利海南油茶特色油茶的健康可持续发展。 同时， 近年也出现海南 本地油茶种苗被引种到内地种植的现象。 实践证明， 海南本地品种区域性较强， 在内地的大 部分地区不适宜种植。 因此， 如何鉴别海南岛油茶资源， 建立快速高效的技术或体系， 显得 尤为急迫。 发明内容 [0003]为了克服现有技术中的至少部分缺陷， 本发明通过对小果油茶、 普通油茶、 香花油 茶， 以及越南油茶中的海南、 广西、 广东三个省份种质， 各一份种质进行叶绿体全基因组测 序和基因组比较分析， 获得在海南岛油茶种质资源中特异变异的含6个碱基缺 失片段， 设计 缺失片段检测引物， 开发了鉴别海南油茶种质的叶绿体 基因组Indel特异性标记。 [0004]本发明的第一个目的是提供鉴别海南岛油茶种质资源的叶绿体基因组InDel标 记。 [0005]本发明的第二个目的是提供用于海南岛油茶种质资源鉴别的I nDel特异性引物。 [0006]本发明的第三个目的是提供鉴别待测海南岛油茶种质资源的方法。 [0007]为了实现上述目的， 本发明是通过以下 方案予以实现的： [0008]S1、 提取待测海南岛 内外油茶种质基因 组DNA。 [0009]S2、 以步骤S1提取的待测样品DNA为扩增模板， 以所述特异性标记引物psbE ‑petL‑ 01作为扩增引物， 进行PCR扩增。 [0010]PCR反应体系(30μL)： 模板DNA  20ng， dNTPs  0.20mmol/L， 序列0.13μmol/L， Taq   DNA聚合酶2.0 0U， ddH2O补至总体积3 0 μL； [0011]反应扩增程序： 94℃预变性5 min； 94℃变性1min， 60℃退火1min， 72℃延伸2min， 进说　明　书 1/7 页 3 CN 114574615 A 3