(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221013132 9.6 (22)申请日 2022.02.14 (71)申请人 海南省农业科 学院三亚研究院 （海 南省实验动物研究中心） 地址 572024 海南省三 亚市崖州湾科技城 用友产业园一 号楼4楼496—9号 (72)发明人 郑道君　戚华沙　陈加利　孙秀秀　 夏腾飞　王春梅　马光耀　 (74)专利代理 机构 北京中安信知识产权代理事 务所(普通 合伙) 11248 专利代理师 赵黎虹 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于海南岛油茶资源鉴定的SNP标记及 检测方法 (57)摘要 本发明涉及一种用于海南岛油茶资源鉴定 的SNP标记及检测方法。 本发明提供了一个用于 海南岛油茶种质资源特异性鉴定的SNP位点， 以 及检测该标记的引物和方法。 对该SNP的检测， 可 实现海南岛油 茶种质资源的快速、 准确鉴定。 为 科学保护海南岛油茶种质资源， 保障海南油茶特 色产业发展， 助力中国油茶产业有序发展提供技 术支撑， 对研究海南岛特色油茶资源起源进化， 以及海南油茶 分子育种具有重要应用意 义。 权利要求书1页 说明书11页 序列表1页 附图2页 CN 114941037 A 2022.08.26 CN 114941037 A 1.鉴定海南岛油茶种质资源的叶绿体基因组SNP位点， 其特征在于， 所述SNP位点位于 叶绿体基因组ycf1基因上， 位于小果油茶叶绿体基因组的128161处位点， 其碱基为C或T， 所 述小果油茶叶绿体 基因组的入库编号 为Banklt2460817Camel lia MZ189740 。 2.用于海南岛油茶种质资源鉴定的SNP特异性引物， 其特征在于， 所述特异性引物命名 为ycf1‑4， ycf1‑4包括一个正向引物和一个反向引物； 正向引物的序列为： 5'CGATCT TGATCCAGGCCTCA3'； 反向引物的序列为： 5'ACA ACACACATA AACATAAGGGCA3'。 3.海南岛油茶种质资源的鉴定方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1、 提取待测油茶种质材 料总基因 组DNA； S2、 以步骤S1提取的待测样品DNA为扩增模板， 以权利要求2中ycf1 ‑4引物为扩增引物 进行PCR扩增； S3、 对步骤S2的PCR产物进行测序， 测序方法为Sanger一代常规测序。 在扩增片段的第 45个位点左右， 种质碱基为 “T”即为海南岛 内种质。 4.根据权利要求3所述的海南岛油茶种质资源的鉴定方法， 其特征在于： 在步骤S2中采 用PCR反应体系30 μL： 包括模板DNA  30ng， dNTPs  0.20mmol/L， 序列0.13 μmol/L， Taq  DNA聚 合酶3.00U， ddH2O补至总体积3 0 μL； 反应扩增程序： 94℃预变性5min； 94℃变性1min， 58℃退火1min， 72℃延伸1.5min， 进行 40个循环； 最后72℃延伸10mi n， 4℃保存； PCR扩增产物检测： PCR扩增产物在含8％Goldview核酸染料的1.5％琼脂糖凝胶上进行 电泳， 在0.5 ×TBE缓冲液中电压100V电泳40min， 跑胶结果在凝胶成像系统中拍照记录， 以 100bp DNA为Marker， 扩增产物仅1个条 带， 且条带大小为183bp左右， 即为目标 条带。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114941037 A 2一种用于海南岛油茶资源鉴定的SNP标记及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学及 植物分子育种技术领域领域， 具体涉及一种用于海南岛 油茶资源鉴定的SNP标记及检测方法。 背景技术 [0002]油茶主产和原产于中国， 是中国重点发展的木本油料作物， 与油菜籽、 花生、 大豆 并称中国4种主要大宗油料作物。 它的茶籽油富含不饱和脂肪酸(可达90％左右， 比油橄榄 高)， 是高级食用油， 同时具有良好的保健药用功效。 油茶目前在中国的栽培面积约7000万 亩， 主要分布在中 国的南方地区。 油茶在 海南俗称“山柚”， 海南岛是中 国油茶资源分布的最 南缘。 由于海南岛气候独特， 海峡隔离， 油茶又是异花授粉植物， 在环境和遗传控制的双重 作用下， 海南岛山柚资源表型变异极为丰富且独特， 茶油品质无苦味香稠度大， 明显区别于 内地茶油。 经鉴定， 海南岛油茶资源属于山茶属油茶组越南油茶的一个特殊类群。 正是由于 不同于内地的茶油品质， 海南茶籽油在市场上的价格为内地的3 ‑5倍。 海南山柚作为海南省 的一个极具 特色的经济作物， 发展势头良好， 2021年栽培面积15万亩左右。 [0003]由于海南油茶产业良好的经济效益， 在种苗市场有大量非本地油茶种源的种苗涌 入海南。 实践证明， 这些种苗种源大部分适应海南岛的生长环境， 出现造林成率低、 生长极 慢、 开花结实低等问题。 同时， 即使有个别的油茶种源能适应海南生境长生， 所产的茶籽油 也不具备本地茶籽油的品质。 此外， 由于海南茶籽油价格高， 每年有 大量的非本地茶籽进入 海南充当本地茶籽用于榨油， 掺合入本地茶籽油， 影响本地茶籽油的品质。 这些极不利海南 油茶特色油茶的健康可持续发展。 同时， 近年也出现海南本地油茶种苗被引种到内地种植 的现象。 实践证明， 海南本地品种区域性较强， 在内地的大部 分地区不适宜种植。 因此， 如何 鉴定海南岛油茶 资源， 建立快速高效的技 术或体系， 显得 尤为急迫。 发明内容 [0004]为了克服现有技术中的至少部分缺陷， 本发明提供了一种用于海南岛油茶资源特 异性鉴定的叶绿体SNP及检测方法。 对特异性SNP所在的叶绿体基因组片段设计引物， 对特 异性SNP进行检测， 高效区分鉴定海南岛油茶种质资源。 [0005]本发明的第一个目的是提供鉴定海南岛油茶种质资源的基因 组SNP位点。 [0006]本发明的第二个目的是提供用于海南岛油茶种质资源鉴定的SNP特异性引物。 [0007]本发明的第三个目的是提供一种海南岛油茶种质资源的鉴定方法。 [0008]为了实现上述目的， 本发明是通过以下 方案予以实现的： [0009]S1、 提取待测香花油茶(Camellia  osmantha)、 小果油茶(C .oleifera   var.mono sperma)、 普通油茶(C.oleifera)， 以及越 南油茶(C.vietnamen sis)在海南岛及海 南岛外分布种质资源的总基因 组DNA； [0010]S2、 以步骤S1提取 的待测样品DNA为扩增模板， 以权利要求2中ycf1 ‑4引物为扩增 引物进行PCR扩增； PCR反应体系30μL： 包括模板DNA  30ng， dNTPs  0.20mmol/L， 序列0.13μ说　明　书 1/11 页 3 CN 114941037 A 3