(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210134618.1 (22)申请日 2022.02.14 (71)申请人 广西壮族自治区农业科 学院 地址 530007 广西壮 族自治区南宁市大 学 东路174号 (72)发明人 李其利　鲁萌萌　唐利华　黄穗萍　 陈小林　马立安　郭堂勋　莫贱友　 (74)专利代理 机构 北京兆君联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11333 专利代理师 胡敬红 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于特异序列的亚洲炭疽菌PCR检测引物及 快速检测方法 (57)摘要 本发明公开了基于特异序列的亚洲炭疽菌 PCR检测引物及快速检测方法。 本发明通过比较 亚洲炭疽菌(Colletotrichum  asianum)和其他 种炭疽菌基因组的方法所得到的亚洲炭疽菌的 特异性分子靶标序列SEQ  ID NO.1， 针对该序列 设计了检测引物对。 该检测引物对特异性好、 稳 定强、 灵敏度高， 达到10pg/ul。 能快速、 准确地检 测出亚洲炭疽菌。 本发明可为亚洲炭疽菌 (Colletotrichum  asianum)的快速检测以及该 菌引起的病害的监测预警提供了 很好的工具。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图4页 CN 114480687 A 2022.05.13 CN 114480687 A 1.亚洲炭疽菌(Co lletotrichum asianum)特异序列， 其序列如SEQ  ID NO.1所示。 2.根据权利要求1所述的特异序列而设计的PCR检测引物对， 如下 所示： caf1： 5’ ‑CCGTCAGACG GAATTATCAGC‑3’； car1： 5’ ‑CCGATCCTGTCTTTGAAATGG‑3’。 3.一种亚洲炭疽菌(Co lletotrichum asianum)的快速PCR检测方法， 步骤如下： S1： 使用引物对 对待测物DNA进行PCR扩增； S2： 用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测扩增产物； S3： 观察扩增产物的条 带大小是否为 419bp； 所述引物对为： caf1： 5’ ‑CCGTCAGACG GAATTATCAGC‑3’； car1： 5’ ‑CCGATCCTGTCTTTGAAATGG‑3’。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 步骤S1中的PCR扩增， 其PCR扩增体系包括： Premix Taq 12.5 μL， 10 μmol/L上、 下游引物caf1、 car1各1 μL， DNA模板1 μL， 最后加灭菌双蒸 水至25 μL。 5.根据权利 要求4所述的方法， 其特征在于， 所述S1中的PCR扩增， 其PCR扩增程序 为： 95 ℃预变性5min； 95℃变性45s； 60℃退火30s； 72℃延伸30s； 变性、 退火、 延伸共31个循环； 最 后72℃延伸7mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480687 A 2基于特异序列的亚洲炭 疽菌PCR检测引物及快速检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学领域， 具体涉及一组基于特异序列的亚洲炭疽菌PCR检测 引物及快速检测方法。 背景技术 [0002]亚洲炭疽菌(Colletotrichum  asianum)是属于胶孢炭疽菌( Colletotrichum   gloeosporioi des)复合种里的一个种。 亚洲炭疽菌是一种 世界性范围的植物病原菌， 在亚 洲、 美洲以及非洲广泛分布， 可对多种植物寄主如芒果、 咖啡、 辣椒、 鳄梨等造成严重的果 实 或叶片炭疽病， 从而导 致农作物严重减产， 给农民带来巨大 经济损失。 [0003]芒果是世界上最重要的热带经济水果之一， 据联合国粮农组织(FAO)统计， 现有 103个国家生产芒果。 截至2018年， 103个芒果生产国和地区的芒果收获面积约为575万公 顷， 年产量约为5538万吨。 据先前的报道， 在中 国南方、 墨西哥以及巴西等芒果主产区， 亚洲 炭疽菌是芒果炭疽病的主要病原菌， 目前， 国内外针对亚洲炭疽菌的快速检测方法未见报 道。 传统的鉴定亚洲炭疽菌的方法主要是通过形态学鉴定结合多基因系统发育分析， 传统 的方法耗时耗力。 因此， 寻找新的亚洲炭疽菌特异性检测靶标 尤为重要。 [0004]生物信息学技术的发展为寻找亚洲炭疽菌特异性检测靶标有着重要的启发， 可以 通过比较基因组的方法来筛选亚洲炭疽菌的特异序列。 随着扩增测序技术的不断进步和优 化， 通过PCR来检测特异序列的成本和时间大大降低。 因此， 寻找亚洲炭疽菌的特异序列以 及快速检测方法将有利于由亚洲炭疽菌引起的炭疽病的监测预警和防控。 发明内容 [0005]本发明的目的在于， 提供一组基于特异序列的亚洲炭疽菌PCR检测引物及快速检 测方法。 [0006]为实现上述目的， 本发明采用的技 术方案是： [0007]利用MUMmer软件对亚洲炭疽菌及不同种炭疽菌之间的基因组序列进行两两比对 得到亚洲炭疽菌中含有的特异序列片段， 如S EQ ID NO.1所示； 该片段可作为鉴定亚洲炭疽 菌的特异性新分子靶标。 通过检测待测物中是否含有 该序列即可确定该待测物是否含有亚 洲炭疽菌 。 [0008]利用常规引物设计软件遵循引物设计原则基于如SEQ  ID NO.1所示特异性分子靶 标序列设计亚洲炭疽菌PCR检测引物。 [0009]亚洲炭疽菌(Co lletotrichum asianum)特异序列， 其序列如SEQ  ID NO.1所示。 [0010]根据上述特异性检测靶标设计的PCR检测引物对， 如下 所示： [0011]caf1： 5’ ‑CCGTCAGACG GAATTATCAGC‑3’； [0012]car1： 5’ ‑CCGATCCTGTCTTTGAAATGG‑3’。 [0013]亚洲炭疽菌的快速PCR检测方法， 步骤如下： [0014]S1： 使用上述引物对 对待测物DNA进行PCR扩增；说　明　书 1/8 页 3 CN 114480687 A 3