(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210139301.7 (22)申请日 2022.02.15 (71)申请人 三亚中国检科院生物安全中心 地址 572025 海南省三 亚市崖州区科技城 标准厂房二期三楼C268区 申请人 中国检验检疫科 学研究院 (72)发明人 宋云　赵文军　李明福　张永江　 许瑾　 (74)专利代理 机构 北京百欧知识产权代理事务 所(普通合伙) 11930 专利代理师 邹晓艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于鉴别重楼品种及其混伪品的引物组、 试 剂盒和方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于鉴别重楼品种及其 混伪品的引物对、 试剂盒和检测方法， 包含1～4 对引物， 引物对选自： SED  ID NO.1‑2所示的引物 对1， SED ID NO.3‑4所示的引物对2， SED  ID  NO.5‑6所示的引物对3， SED  ID NO.7‑8所示的引 物对4； 引物对1、 2、 3、 4分别用于鉴别目标重楼品 种滇重楼、 华重楼、 球药隔重楼、 黑籽重楼。 鉴别 方法包括步骤： 1)提取待测样品的基因组DNA； 2) 采用的引物对或者的试剂盒， 对提取的基因组 DNA进行PCR扩增， 不同的引物对分管扩增； 3)检 测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段， 含有 目的扩增片段的样品鉴别为目标品种阳性。 权利要求书2页 说明书7页 序列表4页 附图4页 CN 114438246 A 2022.05.06 CN 114438246 A 1.一种用于鉴别重楼品种及其混伪品的引物对， 其特征在于： 包含1～4对引物， 引物对 选自： SED  ID NO.1‑2所示的引物对1， SED  ID NO.3‑4所示的引物对2， SED  ID NO.5‑6所示 的引物对3， SED  ID NO.7‑8所示的引物对4； 所述引物对1、 2、 3、 4分别用于鉴别目标重楼品种滇重楼、 华重楼、 球药隔重楼、 黑籽重 楼。 2.如权利要求1所述的引物对， 其特征在于： 还包含1～4个探针， 所述探针的序列选自 SED ID NO.9～12所示的序列， SED  ID NO.9、 SED  ID NO.10、 SED  ID NO.11、 SED  ID NO.12 所示的探针序列分别用于鉴别滇重楼、 华重楼、 球药隔重楼、 黑籽 重楼； 优选探针的5 ’端标记荧光报告基团， 3 ’端标记荧光淬灭基团； 进一步优选所述荧光报 告基团为FAM， 所述 荧光淬灭基团为BHQ1。 3.如权利要求1或2所述的引物对， 其特征在于： 所述混伪品包括北重楼、 皱叶重楼、 长 柱重楼、 五指莲、 独龙重楼。 4.一种用于鉴别鉴别重楼品种及其混伪品的试剂盒， 其特征在于： 包含权利要求1或2 所述的引物对， 还 包含PCR扩增或者实时荧 光PCR扩增的反应试剂。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于： 还包括DNA提取试剂、 阳性对照和阴性对 照， 所述PCR扩增或者实时荧 光PCR扩增的反应试剂包括DNA聚合酶和DNA聚合酶 缓冲液。 6.一种鉴别重楼品种及其混伪品的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 1)提取待测样品的基因 组DNA； 2)采用权利 要求1所述的引物对或者权利 要求4或5所述的试剂盒， 对提取的基因组DNA 进行PCR扩增， 不同的引物对分管扩增； 3)检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段， 含有目的扩增片段的样品鉴别为滇重 楼和/或华重楼和/或球药隔重楼和/或黑籽重楼阳性； 滇重楼、 华重楼、 球药隔重楼、 黑籽重 楼的目的扩增片段的大小依次为394bp、 393bp、 2 97bp、 339bp。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于： 所述PCR扩增的反应体系为： 总体积25μl， 其中， 2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl、 浓度为10 μM的正反向引物各 1 μl、 基因组DNA  1 μl、 余 量为ddH2O； 所述步骤2)中鉴别滇重楼或华重楼或球药隔重楼采用的PCR扩增的反应条件为： 94℃ 3min； 94℃30s,60℃30s,72℃1min,循环30次； 72℃5min； 鉴别黑籽重楼采用的PCR扩增的反 应条件为： 94℃3mi n； 94℃30s,65℃30s,72℃1mi n,循环30次； 72℃5mi n； 优选所述 步骤3)中采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否含有目的条 带。 8.一种鉴别重楼品种及其混伪品的实时荧 光PCR方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 1)提取待测样品的基因 组DNA； 2)采用权利 要求2所述的引物对或者权利 要求4或5所述的试剂盒， 对提取的基因组DNA 进行实时荧光P CR扩增， 不同的引物对分管扩增， 根据扩增结果判断待测对象是否含有目标 重楼品种， 如果Ct＜3 0则判断为目标重楼品种阳性， Ct≥3 0则判断为目标重楼品种阴性。 9.根据权利 要求8所述的方法， 其特征在于： 所述实时荧光PCR的反应体系为： 总体积20 μl， 其中2 ×Premix Ex Taq 10 μl、 浓度为10 μM的上下游引物各 1 μl、 浓度为10 μM的探针0.5 μ l、 基因组DNA  1μl， 余量为ddH2O； qPCR扩增程序为： 95℃预变性30s， 40个循环 的95℃变性 5s、 60℃退火3 0s。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114438246 A 210.权利要求1或2所述的引物 组或者权利要求4或5所述的试剂 盒在鉴别重楼品种及其 混伪品中的应用， 所述重楼品种为滇重楼或华重楼或球药隔重楼或黑籽 重楼； 优选所述混伪品包括北重楼、 皱叶重楼、 长柱重楼、 五指莲、 独龙重楼。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114438246 A 3