(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221013731 1.7 (22)申请日 2022.02.15 (71)申请人 温州医科 大学 地址 325035 浙江省温州市学院西路82号 (72)发明人 蒋朋飞　朱华　张玉阳　张丽芳　 陈平东　崔洲莹　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 有限公司 1 1562 专利代理师 程小芳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于qRT-PCR技术检测lncRNA亚细胞定 位的方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于qRT ‑PCR技术检测 lncRNA亚细胞定位的方法， 涉及生物 检测技术领 域； 包括以下步骤： (1)核质分离： 利用含有 NP‑40 的胞膜裂解液， 对待测细胞进行裂解， 得到胞核 部分、 胞质部分； (2)RNA提取： 对未核质分离的细 胞以及所述胞核部分和所述胞质部分， 采用 Trizol抽提法分别提取总RNA、 核RNA和质RNA； (3)cDNA合成： 将所述核RNA、 所述质RNA和所述总 RNA分别逆转录合成核cDNA、 质cDNA和总cDNA； (4)qRT‑PCR检测； (5)鉴定lncRNA定位。 本发明以 GAPDH为质内参， U6为核内参， 利用qRT ‑PCR技术， 成功检测了l ncRNA亚细胞定位。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图1页 CN 115247204 A 2022.10.28 CN 115247204 A 1.一种基于qRT ‑PCR技术检测lncRNA亚细胞定位的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)核质分离： 利用含有NP ‑40的胞膜裂解液， 对待测细胞进行裂解， 得到胞核部分、 胞 质部分； (2)RNA提取： 对未核质分离的细胞以及所述胞核部分和所述胞质部分， 分别采用 Trizol抽提法提取总RNA、 核RNA和质RNA； (3)cDNA合成： 将所述核 RNA、 所述质RNA和所述总RNA 分别逆转录合成核cDNA、 质cDNA和 总cDNA； (4)qRT‑PCR检测： 以GAPDH为质内参， U6为核内参， 进行qRT ‑PCR检测， 所述核cDNA、 所述 质cDNA和所述总cDNA分别检测lncRNA、 GAPDH和U6， 得到总lncRNA、 总GAPDH、 总U6、 核 lncRNA、 核GAP DH、 核U6、 质lncRNA、 质GAP DH和质U6共9组Ct值数据； (5)鉴定l ncRNA定位： 计算(质lncRNA  Ct值‑质GAPDH Ct值)、 (总lncRNA  Ct值‑总GAPDH Ct值)、 (核lncRNA   Ct值‑核U6 Ct值)、 (总l ncRNA Ct值‑总U6 Ct值)四组数据作为 △Ct； 计算(质lncRNA  Ct值‑质GAPDH Ct值)‑(总lncRNA  Ct值‑总GAPDH Ct值)、 (核lncRNA   Ct值‑核U6 Ct值)‑(总lncRNA Ct值‑总U6 Ct值)两组数据作为 △△Ct； 计算出相应2‑△ △Ct值， 代入下述公式： 细胞质中lncRNA比例＝mean[质lncRNA相应2‑△△Ct/(质lncRNA相应2‑△△Ct+核lncRNA相 应2‑△ △Ct)]×100％； 细胞核中lncRNA比例＝mean[核lncRNA相应2‑△△Ct/(质lncRNA相应2‑△△Ct+核lncRNA相 应2‑△ △Ct)]×100％； 通过lncRNA在细胞质或核中的比例判断其定位。 2.根据权利要求1所述的基于qRT ‑PCR技术检测lncRNA亚细胞定位的方法， 其特征在 于， 所述含有NP ‑40的胞膜裂解液包含以下成分： 50mM  Tris、 1.5mM  MgCl2、 140mM NaCl、 0.5％NP‑40、 1mM DTT和1U/ μL RNAsin。 3.根据权利要求1所述的基于qRT ‑PCR技术检测lncRNA亚细胞定位的方法， 其特征在 于， 在步骤(1)中， 所述裂解的具体操作包括： 待测细胞经PBS溶液洗涤后， 重悬于所述含有 NP‑40的胞膜裂解液进行裂解。 4.根据权利要求3所述的基于qRT ‑PCR技术检测lncRNA亚细胞定位的方法， 其特征在 于， 在步骤(1)中， 所述裂解的条件为冰上裂解5 0min。 5.根据权利要求1所述的基于qRT ‑PCR技术检测lncRNA亚细胞定位的方法， 其特征在 于， 在步骤(4)中， 质内参GAP DH所用引物序列为SEQ  ID NO:3和SEQ  ID NO:4所示序列。 6.根据权利要求1所述的基于qRT ‑PCR技术检测lncRNA亚细胞定位的方法， 其特征在 于， 在步骤(4)中， 核内参U6所用引物序列为SEQ  ID NO:5和SEQ  ID NO:6所示序列。 7.根据权利要求1所述的基于qRT ‑PCR技术检测lncRNA亚细胞定位的方法， 其特征在 于， 在步骤(4)中， 所述qRT ‑PCR的反应体系为： 2 ×CHamQ universal  SYBR qRT‑PCR Master  Mix 10 μL， Primer  1 0.4 μL， Primer  2 0.4 μL， cDNA  1 μL， RNase  Free dH2O补足至20 μL。 8.根据权利要求1所述的基于qRT ‑PCR技术检测lncRNA亚细胞定位的方法， 其特征在 于， 在步骤(4)中， 所述qRT ‑PCR的反应程序为： 95℃30sec， 95℃10sec， 60℃30sec， 95℃ 15sec， 60℃60sec， 95℃15sec 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115247204 A 2一种基于qRT ‑PCR技术检测lncRNA亚细胞定位的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物检测 技术领域， 特别是涉及一种基于qRT ‑PCR技术检测 lncRNA亚 细胞定位的方法。 背景技术 [0002]长链非编码RNA(Long  non‑coding RNA， lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的 RNA， 缺少或无开放阅读编码框， 它可以作为抑癌或促癌因子在人类许多癌症的发生 发展过 程中发挥重要的作用。 对于lncRNA发挥作用的具体方式， 包括了染色质修饰、 转录和转录后 调控等多个层面。 但是， lncRNA的调控方式与其在亚细胞中的分布情况有着密切的联系。 比 如， 定位在细胞核中的lncRNA可能通过调节组蛋白修饰和染色质重构影响目标基因表达、 向目标基因的启动子招募转录因子或抑制剂来调控转录或与转录相关蛋白结合， 防止其与 目标DNA结合等方式发挥作用； 而定位在细胞质中的lncRNA则 更多的影响转录后的生物学 进程。 [0003]因此， 检测其亚细胞定位有助于进一步研究lncRNA发挥作用的具体机制， 以便于 从lncRNA角度探索癌症发病机制， 从而对癌症的诊断及治疗起到积极的作用。 发明内容 [0004]本发明的目的是提供一种基于qRT ‑PCR技术检测 lncRNA亚细胞定位的方法， 以解 决上述现有技术存在的问题， 本发明的方法利用qRT ‑PCR技术实现了lncRNA亚细胞定位检 测。 [0005]为实现上述目的， 本发明提供了如下 方案： [0006]本发明提供一种基于qRT ‑PCR技术检测lncRNA亚细胞定位的方法， 包括以下步骤： [0007](1)核质分离： 利用含有NP ‑40的胞膜裂解液， 对待测细胞进行裂解， 得到胞核部 分、 胞质部分和未核质分离的细胞； [0008](2)RNA提取： 对未核质分离的细胞以及所述胞核部分和 所述胞质部分， 分别采用 Trizol抽提法提取总RNA、 核RNA和质RNA； [0009](3)cDNA合成： 将所述核RNA、 所述质RNA和所述总RNA分别逆转录合成核cDNA、 质 cDNA和总cDNA； [0010](4)qRT‑PCR检测： 以GAPD H为质内参， U6为核内参， 进 行qRT‑PCR检测， 所述核cDNA、 所述质cDNA和 所述总cDNA分别检测lncRNA、 GAPDH和U6， 得到总lncRNA、 总GAPDH、 总U6、 核 lncRNA、 核GAP DH、 核U6、 质lncRNA、 质GAP DH和质U6共9组Ct值数据； [0011](5)鉴定l ncRNA定位： [0012]计算(质lncRNACt值 ‑质GAPDH Ct值)、 (总lncRNACt值 ‑总GAPDH Ct值)、 (核 lncRNACt值 ‑核U6 Ct值)、 (总l ncRNACt值 ‑总U6 Ct值)四组数据作为 △Ct； [0013]计算(质lncRNACt值 ‑质GAPDH Ct值)‑(总lncRNACt值 ‑总GAPDH Ct值)、 (核 lncRNACt值 ‑核U6 Ct值)‑(总lncRNACt值 ‑总U6 Ct值)两组数据作为 △△Ct；说　明　书 1/7 页 3 CN 115247204 A 3