(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210135823.X (22)申请日 2022.02.15 (71)申请人 浙江省农业科 学院 地址 310021 浙江省杭州市上城区德胜中 路298号 (72)发明人 陈红林　刘峰　楼宝　 (74)专利代理 机构 杭州浙科专利事务所(普通 合伙) 33213 专利代理师 沈渊琪 (51)Int.Cl. C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的PCR扩增 引物、 试剂盒及鉴定方法 (57)摘要 一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的PCR扩增 引物、 试剂盒及鉴定方法， 属于分子生物学技术 领域。 本申请 的PCR扩增引物包括性别标记特异 引物和内参基因引物， 所述性别标记特异引物上 游序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述性别标记特异 引物下游序列如SEQ  ID NO.2所示， 所述内参基 因引物上游序列如SEQ  ID NO.3所示， 所述内参 基因引物下游序列如SEQ  ID NO.4所示。 本申请 的PCR扩增引物能够在红螯螯虾早期鉴定 出其遗 传性别； 本申请的方法操作简便、 可进行大批量 鉴定， 鉴别快速、 结果 直观准确。 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图1页 CN 114645083 A 2022.06.21 CN 114645083 A 1.一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的PCR扩增引物， 其特征在于包括性别标记特异引 物和内参基因引物， 所述性别标记特异引物上游序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述性别标记特 异引物下游序列如SEQ  ID NO.2所示， 所述内参基因引物上游序列如SEQ  ID NO.3所示， 所 述内参基因引物下游序列如SEQ  ID NO.4所示。 2.含有权利要求1所述PCR扩增引物的快速鉴定红螯 螯虾遗传性别的试剂盒。 3.一种快速鉴定红螯 螯虾遗传性别的方法， 其特 征在于包括以下步骤： 1） 取红螯螯虾PCR模板， 采用内参基因引物进行PCR扩增， 所述内参基因引物上游序列 如SEQ ID NO.3所示， 所述内参基因引物下游序列如SEQ  ID NO.4所示， 扩增产物进行电泳， 若在100‑200之间显示出一条单一条带， 则说明该模板DNA能够用于鉴定红螯螯虾遗传性别 特异性检测； 2） 取红螯螯虾PCR模板， 采用性别标记特异引物进行PCR扩增， 所述性别标记特异引物 上游序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述性别标记特异引物下游序列如SEQ  ID NO.2所示， 扩增 产物进行电泳， 若在1900bp显示出一条单一条带， 则判定为雌性， 若无条带处理， 则判定为 雄性。 4.如权利要求3所述的方法， 其特 征在于所述红螯 螯虾PCR模板通过以下步骤得到： a） 取1.5mL的无菌 离心管， 加入0.5mL的血淋巴抗凝剂待用； b） 从红螯螯虾螯肢关节处抽取0.5mL的血淋巴， 注入上述无菌离心管中， 迅速混匀后， 于室温条件下3 500rpm离心5mi n； c） 倒去上清， 向沉淀中加入0.5mL的组织裂解液， 并用枪头将沉淀充分悬浮后， 加入10 μ L的20mg/ml蛋白酶K， 58℃水浴3 0min后， 即得红螯 螯虾PCR模板 。 5.如权利要求3所述的方法， 其特征在于PCR反应体系为： 2 ×Hieff  ® PCR Master  Mix(With Dye)12.5 μL， PCR模板  2 μL， 10 μmo l上下游引物各1 μL， d d水8.5 μL。 6.如权利要求3所述的方法， 其特征在于所述步骤1） 中PCR扩增条件为： 94℃  3min， 94 ℃ 30s、 60℃  30s、 72℃  30s， 35个循环， 72℃  10min， 4℃结束； 所述步骤2） 中PCR扩增条件 为： 94℃ 3min， 94℃ 30s、 60℃ 30s、 72℃ 1min30s， 35个循环， 72℃  10min， 4℃结束。 7.如权利要求4所述的方法， 其特征在于所述血淋巴抗凝剂为： EDTA  0.15g， 葡萄糖   1.04g， NaCl  0.93g， 柠檬酸 三钠 0.44g， 加dd水定容至 50mL； 所述组织裂解液为： SDS  2.5g， Tris  0.61g， NaCl  11.7g， EDTA  0.37g， 加dd水定容至 500mL， 并使用NaOH将溶 液pH调制8。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114645083 A 2一种快速鉴定红螯 螯虾遗传性别的PCR扩增引物、 试剂盒及鉴 定方法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学技术领域， 具体涉及一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的 PCR扩增引物、 试剂盒及鉴定方法。 背景技术 [0002]红螯螯虾 （ Cherax quadricarinatus ） ， 隶属于甲壳动物亚门， 软甲纲。 红螯螯虾原 产于澳大利亚， 于1992 年引进我国， 并首先在广东和湖北两省试养成功， 随后在福建、 江苏、 浙江、 江西、 广西等均开展了养殖。 红螯螯虾的适应性强， 生长快速， 无明显的摄食偏好性， 且成体规格大， 离水后可存活 时间长， 便于长途运输。 市场前景可观。 目前， 国内的红螯螯虾 养殖产业仍处于初级阶段， 由于苗种获得不易和缺 乏优质亲本等问题， 红螯螯虾的养殖一 直未得到有效推广， 存在较大的局限性， 因此多地区开展了红螯 螯虾的选 育工作。 [0003]红螯螯虾具有多种性逆转个体类型， 性逆转个体为遗传雌性、 生理雄性， 自然状态 下能够与雌性进行交配繁殖后代， 并导致后代中性逆转个体的比例 升高， 由于性逆转个体 的规格较正常雄性小、 但具有与正常雄性一样的强攻击性， 同时性逆转亲本会导致后代中 雌性比例降低， 这对红螯螯虾的繁殖和养殖经济效益是不利的。 因此在选育过程中需要将 性逆转个体予以剔除， 鉴于性逆转个体具有多种表型性征， 甚至与正常雄性完全一致仅从 表型进行区分十分困难。 此外， 红螯螯虾的单性化养殖需要在其性别 分化早期进行人工诱 导性逆转， 但发育早期的幼虾难以从表型鉴定性别， 因此红螯螯虾遗传性别鉴定分子标记 的开发势在 必行。 发明内容 [0004]针对现有技术存在的问题， 本发明的目的在于设计提供一种快速鉴定红螯螯虾遗 传性别的PCR扩增引物、 试剂盒及鉴定方法的技 术方案。 [0005]本发明具体通过以下技 术方案实现： 本发明一方面提供一种快速鉴定红螯螯虾遗传性别的PCR扩增引物， 其包括性别 标记特异引物和内参基因引物， 所述性别标记特异引物上游序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述 性别标记特异引物下游序列如SEQ  ID NO.2所示， 所述内参基因引物上游序列如SEQ  ID  NO.3所示， 所述内参基因引物下游序列如SEQ  ID NO.4所示。 [0006]本发明另一方面提供含有上述PCR扩增引物的快速鉴定红螯螯虾遗传性别的试剂 盒。 [0007]本发明另一方面 一种快速鉴定红螯 螯虾遗传性别的方法， 其包括以下步骤： 1） 取红螯螯虾PCR模板， 采用内参基因引物进行PCR扩增， 所述内参基因引物上游 序列如SEQ  ID NO.3所示， 所述内参基因引物下游序列如SEQ  ID NO.4所示， 扩增产物进行 电泳， 若在100 ‑200之间显示出一条单一条带， 则说明该模板DNA能够用于鉴定红螯螯虾遗 传性别特异性检测；说　明　书 1/3 页 3 CN 114645083 A 3