(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210137549.X (22)申请日 2022.02.15 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114438177 A (43)申请公布日 2022.05.06 (73)专利权人 中国科学院南海 海洋研究所 地址 511458 广东省广州市南沙区海 滨路 1119号 (72)发明人 王晓雪　郭云学　林兼仲　汤开浩　 高欣宇　古嘉瑜　 (74)专利代理 机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 专利代理师 陈洁娣　刘明星 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) C12N 7/00(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12N 15/78(2006.01) C12N 15/31(2006.01) C12R 1/385(2006.01) 审查员 姜紫耀 (54)发明名称 一种快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法及其 应用 (57)摘要 本发明公开了一种快速定量ssDNA丝状噬菌 体的方法及其应用。 本发明通过采用双层琼脂平 板法和qPCR的方法结合， 建立以Pf4和Pf6 单链丝 状噬菌体每个稀释梯度下的qPCR测定得到的Ct 值(Y轴)与每个稀释梯度下Pf4和Pf6 单链丝状噬 菌体的数量(X轴)的标准曲线。 通过双层琼脂平 板法和qPCR测定的方法结合可以快速高效地对 丝状噬菌体ssDNA 的基因组进行定量， 还可以对 两个同时释放的ssDNA丝状噬菌体进行分别定量 和比较。 权利要求书2页 说明书6页 附图2页 CN 114438177 B 2022.10.04 CN 114438177 B 1.一种非疾病诊断和治疗目的的快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： (1)将铜绿假单胞菌菌液注入微流控装置的医用硅胶管中， 静置， 使细菌吸附在硅胶管 内壁， 启动微流控装置， 以M9培养基在室温下进行细菌的生物膜培养， 收集流出液， 用微孔 滤膜过滤， 得到无菌的噬菌体液； (2)构建同时敲除Pf4和Pf6噬菌体基因的铜绿假单胞菌ΔPf4 ‑Pf6， 将铜绿假单胞菌Δ Pf4‑Pf6菌液与R ‑top培养基 混合后平铺于LB 平板； 以步骤(1)得到的噬菌体液作为原液， 进 行梯度稀释， 将原液和稀释液分别点板于LB平板上， 过夜培养， 根据噬菌斑统计原液和稀释 液中的噬菌体总数量； (3)分别往噬菌体原液和稀释液中加入DNase  I和RNase  I进行处理， 然后以引物对 pfkA‑F/pfkA‑R、 pfiA‑F/pfiA‑R对经DNase  I和RNase  I处理后的噬菌体原液和稀释液进行 qPCR检测， 所述引物对pfkA ‑F/pfkA‑R的序列为pfkA ‑F： 5'‑CGACCTGAAACCAACAAACG ‑3'， pfkA‑R： 5'‑TTAAACCATTGCTGAAAGGG ‑3'； 所述引物对pfiA ‑F/pfiA‑R的序列为： pfiA ‑F： 5'‑ ATGCGGCTGA CCTGGATT ‑3'， pfiA‑R： 5'‑TGAGCGAA CCTCCTGGAAA ‑3'， 测定噬菌体原液和稀释液 中Pf4和Pf6噬菌体的Ct值； (4)根据步骤(2)测得的噬菌体总数量， 以及由步骤(3)测得的Pf4和Pf6噬菌体 的Ct值 计算得到的Pf4和Pf6的比例， 确定噬菌体原液和稀释液中Pf4和Pf6噬菌体各自的数量； (5)以Pf4或Pf6噬菌体每个稀释浓度下测得的Ct值为纵坐标， 每个稀释浓度下测得的 噬菌体数量为横坐标， 建立标准曲线， 根据qPCR测定的Ct值得到对应单个类型丝状噬菌体 的数量； 所述的R‑top培养基的配方为： 每升培养基含1％胰蛋白胨、 0.1％酵母粉、 1％NaCl、 0.8％琼脂， 余 量为水； 所述铜绿假单 胞菌ΔPf4‑Pf6的构建步骤为： S1： 通过PCR从铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA中扩增 出Pf4的上下游区域， 扩增Pf4上游 基因引物ΔPf4 ‑F1： 5'‑GCCCCCGAGCTCGTTATTGGTCGTGGTTGCTTCCC ‑3'和ΔPf4 ‑R1： 5'‑GCCC CCGCTAGCGATCCCAATGCAAAAGCCCC ‑3'， 扩增Pf4下游基因引物ΔPf4 ‑F2： 5'‑GCCCCCGCTAGCT GGAGCGGGCGAA GGGAATCGAACCCTCG ‑3'和ΔPf4 ‑R2： 5'‑GCCCCCAA GTTCAGCCTGGACGA GCACGAAT ACC‑3'； 通过PCR从质粒pPS856中扩增出庆大霉素抗性基因盒， 扩增庆大霉素抗性基因盒引 物pEX18Gm ‑F： 5 '‑AATCTTCTCTCATCCGCCAAAACA ‑3 '和pEX18Gm ‑R： 5 '‑ CGCCCAATACGCAAACCGCCTCTC ‑3'； 然后用ClonExpress  II一步克隆试剂 盒将这三个扩增片 段连接到自杀质粒pEX18Ap中； 采用蔗糖抗性筛选方法， 通过同源重组获得框内缺失突变 体， 即为铜绿假单 胞菌ΔPf4； S2： 以铜绿假单胞菌ΔPf4基因组DNA为模板， 扩增出Pf6的上下游区域， 扩增Pf6上游基 因引物ΔPf6 ‑F1： 5'‑ACGACGGCCA GTGCCAAGCTTTCTGGCTACAAATTGACCACATG ‑3'和ΔPf6 ‑R1： 5'‑AGCGCAGCATTGTTTTGGTCGGCAGACTACAA ‑3'， 扩增Pf6下游基因引物ΔPf6 ‑F2： 5'‑ GACCAAAACAATGCTGCGCTCTAACCGACT ‑3'和ΔPf6 ‑R2： 5'‑GGTACCCGGGGATCCTCTA GAGGGCAAGC CGGCGCGTTC ‑3'； 通过PCR从质粒pPS856中扩增出庆大霉素抗性基因盒； 然后用ClonExp ress  II一步克隆试剂盒将这三个扩增片段连接到自杀质粒pEX18Ap中； 采用蔗糖抗性筛选方法， 通过同源重组获得框内缺失突变 体， 即为铜绿假单 胞菌ΔPf4‑Pf6。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114438177 B 22.根据权利要求1所述的快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述的M9培养基的配方为： 每升培养基含47.8mM  Na2HPO4、 22mM KH2PO4、 6.8mM NH4Cl、 18.7mM NaCl、 100 μM CaCl2、 2mM MgSO4、 0.1％葡萄糖， 余 量为水。 3.根据权利要求1所述的快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述的铜绿假单胞菌菌液的OD600＝1， 所述的静置是静置1h； 所述的微流控装置的流速为 0.1mL/mi n。 4.据权利要求1所述的快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所 述铜绿假单胞菌ΔPf4 ‑Pf6菌液与R ‑top培养基 混合的体积比为3:10； 所述的过夜培养是37 ℃过夜培 养。 5.根据权利要求1所述的快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 所述的DNase  I在噬菌体原液和稀释液中的终浓度为0.02U/ μL， 所述的RNase  I在噬菌体原 液和稀释液中的终浓度为0.02U/ μL， 所述的处 理是在37℃处 理1h。 6.根据权利要求1所述的快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 所述的qPCR的反应体系是2 ×ChamQ SYRB qPCR Master Mix 10μL， 引物F  0.5μL， 引物R   0.5 μL， DEPC 水8 μL， 模板DNA  1 μL； 反应程序是9 5℃ 10min， 然后9 5℃ 15sec， 60℃  1min重复 40个循环， 最后95℃  15sec， 60℃ 1min， 95℃ 15sec结束程序。 7.权利要求1 ‑6任一项所述的快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法在非疾病诊断和治疗 目的的ssDNA丝状噬菌体Pf4和Pf6 定量中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114438177 B 3