(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210137107.5 (22)申请日 2022.02.15 (71)申请人 河北农业大 学 地址 071000 河北省保定市灵雨寺街289号 (72)发明人 袁万哲　郝雪飘　赵款　雷白时　 薛拥志　张武超　 (74)专利代理 机构 北京鑫瑞森知识产权代理有 限公司 1 1961 专利代理师 代芳 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 7/00(2006.01)C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) A61K 39/23(2006.01) A61P 31/20(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小 病毒SD株全长感 染性克隆的构建方法及应用 (57)摘要 本发明提供了一种致鸭短喙与侏儒综合征 的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的构建 方法及应用， 属于病毒技术领域。 本发明通过分 段扩增的方法将新型鹅细小病毒SD株的完整基 因组克隆至质粒pBluescript  II SK， 获得重组 质粒； 同时利用重叠PCR技术将基因组中Nco Ⅰ位 点突变， 作为鉴定野毒与拯救病毒的遗传标记； 然后将重组质粒与转染试剂混合， 通过卵黄囊与 尿囊腔途径接种SPF鸭胚， 获得拯救病毒。 本发明 建立的新型鹅细小病毒反向遗传操作系统， 可用 于新型鹅细小病毒毒力分析、 跨种传播机制等方 向的研究， 同时也为研究鸭短喙与侏儒综合征的 新型疫苗奠定 了基础。 权利要求书2页 说明书9页 序列表6页 附图5页 CN 114480378 A 2022.05.13 CN 114480378 A 1.一种致鸭短 喙与侏儒综合征的新型鹅细小病 毒SD株全长感染性克隆的制备用引物， 其特征在于， 具体序列如SEQ  ID No.1～14所示。 2.一种致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株全长感染性克隆的分子标记引 物， 其特征在于， 具体序列如SEQ  ID No.15～16所示。 3.一种含有基因序列如SEQ  ID No.1～16所示的引物组合的试剂盒。 4.一种针对致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒SD株的拯救系统， 其特征在于， 包括A、 B、 C1、 C2 ‑1、 C2‑2、 D、 E七个片段的扩增产物和两种质粒。 5.如权利要求4所述的拯救系统， 其特征在于， 所述质粒为pSK ‑XBSE和pBluescript  II  SK。 6.一种致鸭短 喙与侏儒综合征的新型鹅细小病 毒SD株全长感染性克隆的构建方法， 其 特征在于， 包括以下步骤： (1)构建克隆C片段的中间质粒pSK ‑XBSE： 选取载体pBluescript  II SK， 合成基因片 段， 进行多克隆位点改造， 获得含如SEQ  ID NO.17所示基因片段的pBluescript  II SK质 粒， 然后转化、 培养、 鉴定， 将阳性菌进行扩繁， 提取质粒， 作为中间质粒， 并命名为pSK ‑ XBSE； (2)提取NGPV  SD F5代病毒基因 组总DNA； (3)设计、 合成覆盖全基因组的引物： 根据 NGPV SD全基因序列， 依据选取的酶切位点设 计相应引物， 包 括六对扩增引物SegA ‑F、 SegA‑R、 SegB‑F、 SegB‑R、 SegC1‑F、 SegC1‑R、 SegC2‑ F、 1‑R、 2‑F、 SegC2‑R、 SegD‑F、 SegD‑R、 SegE‑F、 SegE‑R， 一对突变引物 1‑R、 2‑F以及合成Nco   Ⅰ突变位点的分子标记引物rSD ‑F、 rSD‑R； 所述扩增引物序列如SEQ  ID No.1～12所示， 所述 突变引物序列如SEQ  ID No.13～14所示， 所述分子标记引物序列如SEQ  ID No.15～16所 示； (4)各基因片段的PCR扩增： 首先以NGPV  SD全基因为模板， 利用引物SegA ‑F/SegA‑R、 SegB‑F/SegB‑R、 SegC1 ‑F/ SegC1‑R、 SegC2‑F/1‑R、 2‑F/SegC2‑R、 SegD‑F/SegD‑R、 SegE‑F/SegE‑R进行PCR扩增， 对PCR 扩增产物进行检测 和纯化回收， 得到A、 B、 C1、 C2 ‑1、 C2‑2、 D、 E七个片段； 然后以C2 ‑1与C2‑2回收产物为模板， 以SegC2 ‑F/SegC2‑R为引物进行重叠PCR扩增， 对 目的产物进行回收， 得到 C2片段。 (5)分阶段构建重组质粒pSK ‑SD： ①pSK‑A质粒的构建： 将质粒pBluescript   Ⅱ SK使用Xho  Ⅰ与EcoR Ⅰ进行双酶切获得 目的产物， 然后与A片段进行同源重组， 转化至JM110感受态细胞中处理、 培养获得阳性菌 落， 经过测序证实连接成功后将其进行扩繁， 提取质粒， 命名为pSK ‑A； ②pSK‑E质粒的构建： 将质粒pBluescript   Ⅱ SK使用EcoR  Ⅰ与Not Ⅰ进行双酶切获得 目的产物， 然后与E片段进行同源重组， 转化至D H5α 感受态细胞中处理、 培养获得阳性菌落， 经过测序证实连接成功后将其进行扩繁， 提取质粒， 命名为pSK ‑E； ③pSK‑AB质粒的构建： 使用Sph  Ⅰ与Bcl Ⅰ分别对质粒pSK ‑A与B片段产物进行双酶切获 得目的产 物， 转化至HB101感受态细胞中进行培养， 选择阳性菌落经过测序证实连接成功后 将其进行扩繁， 提取质粒， 命名为pSK ‑AB； ④pSK‑AB(JM110)质粒的构建： 将pSK ‑AB质粒转化至JM110中进行培养， 选择阳性菌落权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114480378 A 2经过测序证实连接成功后将其进行扩繁， 提取质粒， 命名为pSK ‑AB(JM110)； ⑤pSK‑DE质粒的构建： 使用Sph  Ⅰ与EcoR Ⅰ分别对质粒pSK ‑E与D片段产物进行双酶切 获得目的产 物， 转化至HB101感受态细胞中进行培养， 选择阳性菌落经过测序证实连接成功 后将其进行扩繁， 提取质粒， 命名为pSK ‑DE； ⑥pSK‑C1质粒的构建： 使用Bcl  Ⅰ与Sph Ⅰ分别对质粒pS K‑XBSE与C1片段产物进行双酶 切获得目的产物， 转化至DH5α 感受态细胞中进行培养， 选择阳性菌落经过测序证实连接成 功后将其进行扩繁， 提取质粒， 命名为pSK ‑C1； ⑦pSK‑C质粒的构建： 使用Sph  Ⅰ与EcoR Ⅰ分别对质粒pS K‑C1与C2片段产物进行双酶切 获得目的产 物， 转化至JM110感受态细胞中进行培养， 选择阳性菌落经过测序证实连接成功 后将其进行扩繁， 提取质粒， 命名为pSK ‑C； ⑧pSK‑ABC质粒的构建： 使用Xho  Ⅰ与Bcl Ⅰ分别对质粒pS K‑AB与pSK‑C进行双酶切获得 目的产物， 转化至HB101感受态细胞中进行培养， 选择阳性菌落经过测序证实连接成功后将 其进行扩繁， 提取质粒， 命名为pSK ‑ABC； ⑨pSK‑SD质粒的构建： 使用EcoR  Ⅰ与Not Ⅰ分别对质粒pS K‑ABC与pSK ‑DE进行双酶切获 得目的产 物， 转化至HB101感受态细胞中进行培养， 选择阳性菌落经过测序证实连接成功后 将其进行扩繁， 提取质粒， 即得到含有完整克隆的质粒， 命名为pSK ‑SD。 7.一种利用权利要求6所述的构建方法制备的致鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病 毒SD株全长感染性克隆， 其特 征在于， 所述克隆的基因序列如SEQ  ID NO.18所示。 8.一种利用权利要求6所述的构建方法拯救致鸭短 喙与侏儒综合征的新型鹅细小病 毒 SD株的方法， 其特征在于， 首先将 重组质粒pSK ‑SD与转染试剂混合， 然后以0.3mL/枚量经绒 毛尿囊腔与尿囊腔途 经转染混合试剂， 每枚鸭胚接种质粒量为3.0 μg， 接着在接种120h收获 尿囊液， 再经相同途径以0.3mL/枚接种鸭胚进行传代， 在120h后收获尿囊液， 即得拯救病 毒。 9.一种致鸭短 喙与侏儒综合征的新型鹅细小病 毒SD株拯救病 毒的鉴别方法， 其特征在 于， 首先设计遗传标记ΔNco  Ⅰ引物， 具体序列如SEQ  ID NO.15～16所示； 然后提取拯救病 毒DNA； 采用遗传标记ΔNco  Ⅰ引物对A、 B、 C、 D、 E五个片段进行PCR扩增， 对PCR扩增产物进行 检测和纯化回收， 再使用Nco  Ⅰ限制内切酶进行酶切反应； 若为拯救病毒则Nco  Ⅰ无法切开 回收产物。 10.权利要求1～2任一所述的引物或权利要求3所述的试剂盒或权利要求4～5任一所 述的拯救系统或权利要求7所述的新型鹅细 小病毒SD株全长感染性克隆在制备致鸭短喙与 侏儒综合征新型 鹅细小病毒S D株诊断试剂和/或疫苗中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114480378 A 3