(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210142330.9 (22)申请日 2022.02.16 (71)申请人 中国人民解 放军陆军 军医大学第二 附属医院 地址 400037 重庆市沙坪坝区新 桥正街83 号 (72)发明人 刘飞　陈雪梅　张立群　郭铭静　 付杰　冯春凤　陈曼　项贵明　 (74)专利代理 机构 重庆强大凯创专利代理事务 所(普通合伙) 50217 专利代理师 陈雍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于肝癌circRNA标志 物检测的试剂盒 (57)摘要 本发明涉及分子诊断技术领域， 具体涉及一 种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒， 包括 RPA单元， 所述RPA单元包括用于检测circ_ 0001649的第一子 单元和用于检测cir c_0009910 的第二子 单元。 本技术方案采用重组酶聚合酶扩 增技术对作为肝癌标志物的circRNA进行检测， 可在较短的时间内且在室温环 境下可完成反应， 并提升了检测灵敏度和特异性。 本方案的试剂盒 同时对circ_0001649和circ_0009910两种 circRNA进行检测， 进 一步提升检测的准确程度。 除此之外， 本技术方案对血液中的干扰物的抗干 扰性强， 不需要对样品进行复杂的除杂质处理， 具有良好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书10页 序列表3页 附图5页 CN 114540494 A 2022.05.27 CN 114540494 A 1.一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒， 其特征在于： 包括RPA单元， 所述RPA单 元包括用于检测circ_0 001649的第一子单 元和用于检测circ_0 009910的第二子单 元。 2.根据权利要求1所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒， 其特征在于： 所 述第一子单元和所述第二子单元均包括反义引物、 正义引物和探针； 所述探针含有一个四 氢呋喃修饰的碱基， 四氢呋喃修饰的碱基的两侧分别修饰有6 ‑羧基荧光素和黑洞淬灭基团 1； 所述探针的3 ’末端的bl ock基团为C3Spacer。 3.根据权利要求2所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒， 其特征在于： 6 ‑ 羧基荧光素和黑洞淬灭基团1之间 间隔2‑3个碱基。 4.根据权利要求3所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒， 其特征在于： 所 述第一子单元包括序列如SEQ  ID NO.1所示的、 序列如SEQ  ID NO.2所示的和序列如SEQ  ID  NO.3所示的反义引物， 序列如SEQ  ID NO.4所示的、 序列如SEQ  ID NO.5所示的和序列如SEQ   ID NO.6所示的正义引物， 以及序列如SEQ  ID NO.7所示的和序列如SEQ  ID NO.8所示的探 针。 5.根据权利要求4所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒， 其特征在于： 所 述第二子单元包括序列如SEQ  ID NO.9所示的、 序列如SEQ  ID NO.10所示的和序列如SEQ   ID NO.11所示的反义引物， 序列如SEQ  ID NO.12所示的、 序列如SEQ  ID NO.13所示的和序 列如SEQ ID NO.14所示的正义引物， 以及序列如SEQ  ID NO.15所示的和序列如SEQ  ID  NO.16所示的探针。 6.根据权利要求5所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒， 其特征在于： 所 述第一子单元包括序列如SEQ  ID NO.1所示的反义引物， 序列如SEQ  ID NO.4所示的正义引 物， 以及序列如SEQ  ID NO.7所示的探针。 7.根据权利要求6所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒， 其特征在于： 所 述第二子单元包括序列如SEQ  ID NO.9所示的反义引物， 序列如SEQ  ID NO.12所示的正义 引物， 以及序列如SEQ  ID NO.15所示的探针。 8.根据权利要求7所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒， 其特征在于： 所 述第一子单 元的最低检测限为10拷贝。 9.根据权利要求8所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒， 其特征在于： 所 述第二子单 元的最低检测限为1 1拷贝。 10.根据权利 要求9所述的一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒， 其特征在于： 所 述第一子单 元和第二子单 元的工作温度均为3 6‑42℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540494 A 2一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及分子诊 断技术领域， 具体涉及一种用于肝癌circRNA标志物检测的试 剂盒。 背景技术 [0002]环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子， 也是RNA领域最新的研究热点。 与传统的线性RNA(linear  RNA， 含5’和3’末端)不同， circRNA分子呈封闭环状结构， 不受 RNA外切酶影 响， 表达更稳定， 不易降解。 在功能上， circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合 位点， 在细胞中起到miRNA海绵(miRNA  sponge)的作用， 进而解除miRNA对其靶基因的抑制 作用， 升高靶基因的表达水平。 通过与疾病关联的miRNA相互作用， circRNA在 疾病中发挥着 重要的调控作用。 目前针对circRNA检测常用方法主要有RT ‑PCR、 Northern  blot和Co ‑IP 等， 但这些检测方法均存在不同程度的缺陷， 难以满足临床以及床旁检测对肝癌早期诊断 的需求， 使 得检测技术很难在中小医院推广。 另外， circRNA不同于普通mRNA， 这对引物和探 针的设计提出了非常高的要求。 综上， 临床和实验室都迫切需要开 发新的高敏、 特异、 简 便、 快速的circRNA检测新技术和新方法， 以提升肝癌检测的准确度和拓展circRNA检测方法的 适应范围。 发明内容 [0003]本发明意在提供一种用于肝癌circRNA标志物检测的试剂盒， 以解决现有的对 circRNA的检测技 术灵敏度、 特异性和简便快捷程度不能满足应用需求的技 术问题。 [0004]为达到上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0005]一种用于肝癌circ RNA标志物检测的试剂盒， 包括RPA单元， 所述RPA 单元包括用于 检测circ_0 001649的第一子单 元和用于检测circ_0 009910的第二子单 元。 [0006]采用上述 技术方案的原理以及优点在于： [0007]本技术方案采用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase  Polymerase   Amplification， RPA)这一新型恒温核酸扩增技术， 对作为肝癌标志物的circRNA进行检测。 其基本原理是由单链结合蛋白(SSB)置换DNA双链形成单链， 代替常规PCR热变性的双链打 开功能。 其扩增循环转换极快， 可高速度指数扩增， 在较短的时间内可完成RPA反应， 并且 RPA反应在室温下进行。 本方案使用RPA技术解决了 现有的对circRNA的检测技术灵敏度、 特 异性和简便快捷程度不能满足应用需求的技 术问题。 [0008]circ_0001649和circ_0009910均为可作为肝癌标志物的circRNA， 发明人通过大 量实验研究发现单一种类circRNAs 的灵敏度和特异性存在各自不足。 在实验过程中发现， 采用本方案的试剂盒检测circ_0001649， 其检测特异性比检测circ_0009910高； 但是， 其检 测灵敏度比检测circ_0009910稍低(详见实验例3和实验例4)。 因此， 对circ_0001649和 circ_0009910的检测如果单独进行， 则很容易出现假阳性 或者假阴性的结果。 所以， 需要设 置试剂盒对circ_0001649和circ_0009910进行同时检测， 在同时阳性的情况下， 提示肝癌说　明　书 1/10 页 3 CN 114540494 A 3