(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210142514.5 (22)申请日 2022.02.16 (71)申请人 湖州申科生物技 术有限公司 地址 313000 浙江省湖州市吴兴区红丰路 1366号3幢10层10 07-1 (72)发明人 吴婉欣　宗伟英　程丹妮　 (74)专利代理 机构 浙江千克知识产权代理有限 公司 33246 专利代理师 杨学强 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12R 1/465(2006.01) (54)发明名称 检测玫瑰孢链霉菌残留DNA的引物对、 检测 试剂及检测方法 (57)摘要 本发明涉及生物检测领域， 尤其涉及检测玫 瑰孢链霉菌残留DNA的引物对、 包含该引物对的 检测试剂及试剂盒， 以及利用该引物对玫瑰孢链 霉菌残留DNA的检测方法， 所述引物对特异性结 合于SEQ ID NO:1所示序列。 本发明中的引 物对 能够针对玫瑰孢链霉菌残留DNA特异性结合， 并 且能够区分其他真核细胞， 不会与其他的DNA发 生干扰， 同时具有极高的精密度， 在较宽的浓度 范围内依然能够保持线性要求， 并且重复性能良 好。 此外， 玫瑰孢链 霉菌DNA参考品碎片化并不影 响qPCR的检测， 且该检测方法还具有操作 简便快 捷的优势。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图4页 CN 114540514 A 2022.05.27 CN 114540514 A 1.一种用于检测玫瑰孢 链霉菌残留DNA的引物对， 其特 征在于， 所述引物对 包括正向引物和反向引物， 其中： 所述正向引物如SEQ  ID NO:2所示； 所述反向引物如SEQ  ID NO:3所示。 2.一种用于检测玫瑰孢 链霉菌残留DNA的检测试剂， 其特 征在于， 所述检测试剂包括如权利要求1所述的引物对。 3.根据权利要求2所述的一种用于检测玫瑰孢链霉菌残留DNA的检测试剂， 其特征在 于， 还包括探针。 4.根据权利要求3所述的一种用于检测玫瑰孢链霉菌残留DNA的检测试剂， 其特征在 于， 所述探针端部标记有荧 光报告基团FAM以及淬灭基团TAMRA。 5.根据权利要求4所述的一种用于检测玫瑰孢链霉菌残留DNA的检测试剂， 其特征在 于， 所述探针如SEQ  ID NO:4所示。 6.一种玫瑰孢 链霉菌残留DNA的检测试剂盒， 其特 征在于， 其包含如权利要求1所述的引物对或者如权利要求2~5中任意一项所述的检测试剂。 7.根据权利要求6所述的玫瑰孢 链霉菌残留DNA的检测试剂盒， 其特 征在于， 还包括： qPCR  reaction buffer、 DNA稀释液、 DNA定量 参考品以及样品提取 纯化液。 8.一种玫瑰孢 链霉菌残留DNA的检测方法， 其特 征在于， 所述方法包括： 利用如权利要求1所述的引物对或者如权利要求2~5中任意一项所述的 检测试剂或者如权利要求6或7所述的检测试剂盒， 对待测样 品进行qPCR， 并检测qPCR扩增 产物。 9.如权利要求1所述的引物对或者如权利要求2~5中任意一项所述的检测试剂或者如 权利要求6或7所述的检测试剂盒的用途， 用于检测待测对象中是否存在玫瑰孢链霉菌残留 DNA。 10.根据权利要求9所述的用途， 其特 征在于， 所述待测对象为达托霉素。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114540514 A 2检测玫瑰孢链 霉菌残留DNA的引物对、 检测试剂及检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物检测领域， 尤其涉及 检测玫瑰孢链霉菌残留DNA的引物对、 检测试 剂及检测方法。 背景技术 [0002]达托霉素 （Daptomycin） 是一种新型环脂肽 类抗生素， 主要通过扰乱细胞膜对氨基 酸的转运， 从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成， 改变细胞质膜的性质， 能在多个方面破 坏细菌细胞膜功能， 并迅速杀死革兰氏阳性菌。 由于其独特的结构及特殊的药物机制， 被视 为多重耐药革兰阳性细菌引起的重症感染的最后一道防线， 达托霉素对于各种抗生素的耐 药菌都有很好的抑菌活性。 [0003]微生物发酵方法简单快速、 产量较高且污染较小， 是达托霉素大规模生产所用方 法的主流。 达托霉素多由玫瑰孢链霉菌 （ Streptomyces  roseosporus ） 经发酵后通过半合成 法获得。 而在发酵生产后可能残留有玫瑰孢链霉菌的基因组DNA， 则存在感染性、 致癌性、 免 疫原性、 诱变性等潜在风险。 因此， 达托霉素中残留玫瑰孢链霉菌基因组DNA的检测则非常 重要。 [0004]实时荧光定量聚合酶链式反应 （qPCR） 方法指在PCR反应体系中加入荧光基 团， 将 传统的端点检测P CR与荧光检测技术相结合， 通过荧光与扩增反应中双链DNA的数量直接相 关的原理， 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程， 实现对目标核酸片段的定量。 借助该 方法可通过标准曲线对未知 模板进行定量分析。 该方法因特异 性强、 灵敏度高、 准确度好和 操作方便等优势， 成为检测生物制品中宿 主残留DNA的技术趋势， 已被各国相关监管机构认 可的主流 技术， 是欧美最 新药典中的推荐方法。 [0005]WHO、 FDA以及我国的药品监管机构对生物制品中的DNA残留都有限量要求。 对于 非 口服生物制品， WHO和我国对残留DNA的限定要求为不超过10ng/剂， FDA限定要求为100pg/ 剂。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种检测生物制品中玫瑰孢链霉菌残留DNA的引物对、 检 测试剂以及方法。 [0007]为实现上述发明目的， 本发明通过以下技 术方案实现： 在第一方面， 本发明首 先提供了一种用于检测玫瑰孢 链霉菌残留DNA的引物对， 所述引物对 包括正向引物和反向引物， 其中： 所述正向引物如SEQ  ID NO:2所示； 所述反向引物如SEQ  ID NO:3所示。 [0008]在第二方面， 本发明提供了一种用于检测玫瑰孢链霉菌残留DNA的检测 试剂， 所 述检测试剂包括如第一方面所述的引物对。 [0009]在具体的实施 方式中， 所述正向引物如SEQ  ID NO:2所示， 所述反向引物如SEQ  ID 说　明　书 1/8 页 3 CN 114540514 A 3