(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210143354.6 (22)申请日 2022.02.16 (71)申请人 上海长岛抗体诊断试剂有限公司 地址 201415 上海市奉贤区庄行镇 航南公 路8318号2号楼 (72)发明人 肖国伟　龚伟伟　 (74)专利代理 机构 上海专利商标事务所有限公 司 31100 专利代理师 陶启长　韦东 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6827(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 从粪便提取肠上皮细胞DNA的方法 (57)摘要 本发明涉及从粪便提取肠上皮细胞特定DNA 的方法。 具体公开了一种从粪便提取肠上皮细胞 特定DNA的方法包括步骤： (1)将粪便样品与细胞 裂解液孵育， 获得含DNA的混合物， (2)将混合物 与PVPP接触， 获得去除抑制剂的DNA 。 本发明所述 方法具有重复好， 操作简单， 不需要特殊仪器设 备等优点。 权利要求书2页 说明书9页 序列表3页 附图2页 CN 114807118 A 2022.07.29 CN 114807118 A 1.一种从粪便样品中富 集肠上皮细胞DNA的方法， 包括 步骤： (1)将粪便样品与细胞裂解液孵 育， 获得含DNA的混合物， (2)将混合物与PVP P接触， 获得去除抑制剂的DNA， 任选的(3)将DNA与离液盐接触， 优选地， 步骤(2)包括： 在含DNA的混合物中加入终浓度1 ‑20％(g/ml)的PVPP并孵育， 更 优选地， PVP P的终浓度为2 ‑10％， 更优选约5％。 2.如权利要求1中任一项所述的方法， 其特 征在于， 步骤(1)的孵 育是冷冻孵 育， 优选冷冻孵 育5‑18小时， 和/或 细胞裂解液包 含EDTA、 Tris、 碱金属盐， 任选还 包含抗生素， 和/或 粪便样品与细胞裂解液的比例为10 ‑30％， 和/或 离液盐是异硫氰酸胍， 其在液体中的终浓度为1.0 ‑5.0M， 优选2.0 ‑3.0M。 3.一种从粪便样品中分离或检测靶DNA的非诊断方法， 包括 步骤： (1)将粪便样品与细胞裂解液孵 育， 获得含DNA的混合物， (2)将混合物与PVP P接触， 获得去除抑制剂的DNA， 任选的(3)将DNA与离液盐接触， (4)使针对 靶DNA的寡核苷酸捕获探针在核酸杂交的条件下与所述DNA接触， (5)分离或检测寡核苷酸捕获探针或由其捕获的DNA， 从而分离或检测靶DNA， 优选地， 步骤(2)包括： 在含DNA的混合物中加入终浓度1 ‑20％(g/ml)的PVP P并孵育， 更优选地， PVP P的终浓度为2 ‑10％， 更优选约5％。 4.如权利要求3所述的方法， 其特 征在于， 细胞裂解液包 含EDTA、 Tris、 碱金属盐， 任选还 包含抗生素， 和/或 步骤(1)的孵 育是冷冻孵 育， 优选冷冻孵 育5‑18小时， 和/或 粪便样品与细胞裂解液的比例为10 ‑30％， 优选约20％， 和/或 离液盐是异硫氰酸胍， 其在反应液中的终浓度为5 ‑50％， 优选20 ‑40％。 5.如权利要求3或4所述的方法， 其特 征在于， 所述靶DNA是包 含SEPT9、 S DC2或ACTB基因的DNA片段， 和/或 所述寡核苷酸捕获探针包 含SEQ ID NO:1‑3中任一所示的序列， 和/或 步骤(5)中的检测靶DNA是对 靶DNA进行甲基化检测。 6.如权利要求3或4所述的方法， 其特 征在于， 所述寡核苷酸捕获探针包 含标记部分， 例如生物素， 和/或 步骤(5)包括： 使用结合剂选择性捕获靶DNA， 所述结合剂与所述寡核苷酸捕获探针的 标记部分选择性结合； 优选地， 所述结合剂是与生物素选择性结合的试剂， 例如亲和素或链 霉亲和素， 和/或 所述结合剂与固相载体偶联， 从而通过物理或化学 过程纯化靶DNA， 和/或 所述方法还 包括使用洗脱液从固相载体上洗脱DNA的步骤。 7.PVPP， 或PVPP和寡核苷酸捕获探针在制备用于从粪便样品中富集肠癌肿瘤细 胞DNA， 或分离或检测肠癌肿瘤细胞中靶DNA的试剂盒 中的用途， 其中， 在粪便样品经细胞裂解液 处 理后， 将获得的含DNA的混合物与PVP P接触， 获得去除抑制剂的DNA。 8.如权利要求7所述的用途， 其特征在于， 其特征在于， 所述用途还具有选自以下一项权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114807118 A 2或多项的特征： PVPP在所述混合物中的浓度为2 ‑20％(g/ml)， 含DNA的混合物与PVP P的孵育时间为5 ‑60min， 所述试剂盒还包含细 胞裂解液； 优选地， 细 胞裂解液包含EDTA、 Tris、 碱金属盐， 任选还 包含抗生素， 所述试剂盒还包含离液盐， 所述离液盐优选是异硫氰酸胍， 其在反应液中的终浓度为 5‑50％， 优选20 ‑40％， 所述靶DNA是包 含SEPT9、 S DC2或ACTB基因的DNA片段， 所述寡核苷酸捕获探针包 含SEQ ID NO:1‑3中任一所示的序列， 所述寡核苷酸捕获探针包 含标记部分， 例如生物素， 所述试剂 盒还包含结合剂， 所述结合剂与 所述寡核苷酸捕 获探针的标记部分选择性结 合； 优选地， 所述结合剂是与生物素选择性结合的试剂， 例如亲和素或链霉亲和素， 所述试剂盒还 包含与所述结合剂偶联的固相载体， 例如磁颗粒， 所述试剂盒还 包含DNA甲基化检测所需的试剂； 优选地， 富集肠癌肿瘤细胞DNA的方法包括以下步骤： (1)将粪便样品与细胞裂解液孵育， 获得 含DNA的混合物， (2)将混合物与PVPP接触， 获得去除抑制剂的DNA， 和任选的(3)将DNA与离 液盐接触； 优选地， 富 集肠癌肿瘤 细胞DNA的方法如权利要求1或2所述， 富集、 分离或检测肠癌肿瘤细胞中靶DNA的方法包括以下步骤： (1)将粪便样品与细胞 裂解液孵育， 获得含DNA的混合物， (2)将混合物与PVPP接触， 获得去除抑制剂的DNA， 任选的 (3)将DNA与离液盐接触， (4)使针对靶DNA的寡核苷 酸捕获探针在 核酸杂交的条件 下与所述 DNA接触， 富集靶DNA， 和(5)分离或检测寡核苷酸捕获探针或由其捕获的DNA， 从而分离或检 测靶DNA； 优选地， 富集、 分离或检测肠癌肿瘤细胞中靶DNA的方法如权利要求3 ‑6中任一项 所述。 9.一种从粪便样品中富集细胞DNA， 或分离或检测细胞中靶DNA的试剂盒， 包含细胞裂 解液和PVP P， 任选还 包含离液盐。 10.如权利要求9所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还具有选自以下一项或多项 的特征： 细胞裂解液包 含EDTA、 Tris、 碱金属盐， 任选还 包含抗生素， 所述离液盐是异硫氰酸胍； 优选地， 异硫氰酸胍在反应液中的终浓度为5 ‑50％， 所述靶DNA是包 含SEPT9、 S DC2或ACTB基因的DNA片段， 所述试剂 盒还包含针对所述靶DNA的寡核苷酸捕 获探针； 优选地， 寡核苷酸捕 获探针的 序列如SEQ  ID NO:1‑3中任一所示， 所述寡核苷酸捕获探针包 含标记部分， 例如生物素， 所述试剂 盒还包含结合剂， 所述结合剂与 所述寡核苷酸捕 获探针的标记部分选择性结 合； 优选地， 所述结合剂是与生物素选择性结合的试剂， 例如亲和素或链霉亲和素， 所述试剂盒还 包含与所述结合剂偶联的固相载体， 例如磁颗粒， 所述试剂盒还 包含DNA甲基化检测所需的试剂。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114807118 A 3