(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221014025 0.X (22)申请日 2022.02.16 (66)本国优先权数据 202210113452.5 202 2.01.29 CN (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 周继勇　董伟仁　顾金燕　颜焰　 金玉兰　彭曦冉　 (74)专利代理 机构 浙江千克知识产权代理有限 公司 33246 专利代理师 赵芳 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种非洲猪瘟病毒基因II型和非II型的快 速鉴别方法及其应用 (57)摘要 一种非洲猪瘟病毒基因II型和非II型的快 速鉴别方法及其应用， 本发明对B646L基因的特 异性差异位点1500位核苷酸进行检测， 非洲猪瘟 病毒基因II型为C， 基因非II型为T。 通过设计病 毒不同基因型差异位点的特异性引物来有效区 分非洲猪瘟病毒基因II型和非II型。 筛选得到的 引物对非洲猪瘟病毒基因II型的扩增效率高， 对 非洲猪瘟病毒基因非II型扩增效率低， 不需通过 测序即可判断非洲猪瘟病毒基因型为II型或非 II型， 检测速度快， 成本低。 权利要求书1页 说明书6页 序列表4页 附图1页 CN 114645099 A 2022.06.21 CN 114645099 A 1.一种非洲猪瘟病毒基因II型和非II型的快速鉴别方法， 其特征在于该方法是： 对 B646L基因的特异性差异位点1500位核苷酸进行检测， 非洲猪瘟病毒基因II型为C， 基因非 II型为T。 2.一种探针， 其特征在于， 该探针的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 即Probe： 5 ’ ‑FAM‑ CAGATATAGATGA ACATGCGTCTG GAAGAGC‑BHQ1‑3’。 3.根据权利要求2所述的探针， 其特征在于： 所述探针序列5 ’端标记的荧光基团FAM由 HEX、 VIC、 CY5、 TET 中的一种代替， 所述探针序列3 ’端标记的淬灭基团BHQ1 由与荧光基团搭 配使用的淬灭基团代替， 所述淬灭基团选自BHQ ‑2、 BHQ‑3、 TAMRA或DABC YL。 4.一种引物组合物， 其特 征在于该引物组合物包括 正向引物和反向引物， 其中， II型正向引物选自以下三 者之一： II型引物F1： 5 ’ ‑GTTGTTAACGCCATTATGCAGCAC ‑3’， 其核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示， 或II型引物F2： 5 ’ ‑GTTGTTAACGCCATTATGCAGCGC ‑3’  ， 其核苷酸序列如SEQ  ID No.3所 示， 或II型引物F3： 5 ’ ‑GTTGTTAACGCCATTATGCAGACC ‑3’  ， 其核苷酸序列如SEQ  ID No.4所 示； 反向引物R： 5 ’ ‑GTGGAAGGGTATGTAAGAGCTGCAGA ‑3’， 其核苷酸序列如SEQ  ID No.6所示。 5.一种B646L基因突变的检测体系， 包括引物和探针， 其特 征在于： 所述引物用于扩增包含特异性差异位点的核酸片段， 包括II型正向引物、 通用正向引 物和反向引物， II型正向引物， 其核苷酸序列选自SEQ  ID No.2， SEQ ID No.3或SEQ ID No.4中之一， 通用正向引物F： 5 ’ ‑GACATGTTGTTAACGCCATTAT GCAG‑3’  ， 其核苷酸序列如SEQ  ID No.5 所示； 反向引物R， 其核苷酸序列如SEQ  ID No.6所示； 所述探针， 其核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示。 6.一种快速区分非洲猪瘟病毒基因II型和非II型的试剂盒， 该试剂盒含有权利要求2 所述探针， 或权利要求5所述引物组合物， 或权利要求6所述B646L基因突变的检测体系。 7.一种权利要求2所述探针， 或权利要求4所述引物组合物， 或权利要求5所述B646L基 因突变的检测体系在快速区分非洲猪瘟病毒基因I I型和非I I型中的应用。 8.一种非洲猪瘟病毒基因II型和非II型的快速鉴别方法， 其特征在于该方法包括如下 步骤： S1、 从样品中提取或释放病毒DNA， 作为模板； S2、 用权利要求5所述的通用正向引物、 反向引物和探针进行扩增， 获得Ct值1； 同时用 权利要求5所述的I I型正向引物、 反向引物和探针进行扩增， 获得Ct值2； S3、 计算Ct值1和Ct值2的差值， |  Ct值2‑ Ct值1| ≤3， 表明检测到的非洲猪瘟病毒基 因型为II型； | Ct值2‑  Ct值1|>3， 表明检测到的非洲猪瘟病毒基因型为非I I型。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114645099 A 2一种非洲猪瘟病毒基因I I型和非I I型的快速鉴别方 法及其 应用 技术领域 [0001]本发明属于病毒检测技术领域， 具体涉及一种非洲猪瘟病毒基因II型和非II型的 快速鉴别方法及其应用。 背景技术 [0002]我国是全球第一大猪肉生产和消费大国， 猪肉产量约占全球的一半。 非洲猪瘟是 目前对世界养猪业造成重大危害和经济损失的最重要的几种疫病之一， 是全球公认的养猪 业“头号杀手 ”。 非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(Afric an Swine FeverVirus， ASFV)引起的猪 的一种急性、 热性、 高度接触性动物传染病， 对家猪呈现高致死性， 高致病性毒株死亡率可 达100％， ASFV在组织和环境中的抵抗能力强， 加之目前尚无有效的疫苗和治疗药物， 一旦 其广泛传播， 严重影响我国民生乃至生猪产业相关的国际贸易。 [0003]根据B646L基因可将ASFV分为24个基因型， 其中有些基因型毒株仅在某个国家出 现， 而一些基因型毒株则在多个国家传播(如I、 II、 V、 VIII、 X和XII)。 我国流行的ASFV属于 基因II型。 为了监控我国ASFV的分布及流行趋势、 追溯疫源以便及时采 取应对措施， 开展我 国流行毒株(基因I I型)和其 他基因型毒株(非基因I I型)的快速鉴别诊断具有重要的意 义。 发明内容 [0004]鉴于此， 本 发明的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒基因II型和基因非II型的快速 鉴别方法， 发现它们的特征性差异位点为1500C/T， 其中非洲猪瘟病毒基因II型为C， 基因非 II型为T。 [0005]本发明的目的在于提供一种快速区分非洲猪瘟病毒基因I I型和非I I型的引物； [0006]本发明的目的在于提供一种快速区分非洲猪瘟病毒基因I I型和非I I型的探针； [0007]本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒检测的引物和探针； [0008]本发明的目的在于提供一种快速区分非洲猪瘟病毒基因I I型和非I I型的试剂盒； [0009]本发明的目的在于提供上述引物、 探针及 其试剂盒在快速区分非洲猪瘟病毒基 因 II型和非I I型中的应用。 [0010]本发明解决其 技术问题所采用的技 术方案是： [0011]一种非洲猪瘟病毒基因II型和非II型的快速鉴别方法， 该方法是： 对B 646L基因的 特异性差异位 点1500位核苷酸进行检测， 非洲猪瘟病毒基因I I型为C， 基因非I I型为T。 [0012]本发明方法通过设计病毒不同基因型差异位点的特异性引 物来有效区分非洲猪 瘟病毒基因I I型和非I I型。 [0013]一种探针， 该探针的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 即Probe： 5 ’‑FAM‑ CAGATATAGATGA ACATGCGTCTG GAAGAGC‑BHQ1‑3’。 [0014]作为优选， 所述探针序列5 ’端标记的荧光基团FAM由HEX、 VIC、 CY5、 TET中的一种代 替， 所述探针序列3 ’端标记的淬灭基团BHQ1由与荧光基团搭配使用的淬灭基团代替， 所述说　明　书 1/6 页 3 CN 114645099 A 3