(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210151323.5 (22)申请日 2022.02.16 (71)申请人 中国农业科 学院哈尔滨兽医研究所 (中国动物卫 生与流行病学中心哈 尔滨分中心) 地址 150009 黑龙江省哈尔滨市南岗区马 端街427号 (72)发明人 高立　高玉龙　王笑梅　李凯　 祁小乐　刘长军　张艳萍　崔红玉　 (74)专利代理 机构 北京科龙寰宇知识产权代理 有限责任公司 1 1139 专利代理师 马鑫 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测或区分禽呼肠孤病毒4种不同 基因型的多重PCR试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测或区分禽呼肠 孤病毒4种不同基因型的多重PCR试剂盒及其应 用。 所述的试剂盒中含有多重PCR引物组。 所述的 多重PCR引物组由1条通用上游引物， 和分别用于 扩增ARV‑Ⅰ、 ARV‑Ⅰ‑sub、 ARV‑Ⅱ以及ARV‑Ⅴ特异 性基因区域的4条特异性下游引物组成， 其中上 游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 分别 用于扩增ARV ‑Ⅰ、 ARV‑Ⅰ ‑sub、 ARV‑Ⅱ、 ARV‑Ⅴ特异 性基因区域的4条特异性下游引物的核苷酸序列 如SEQ ID NO.2‑5所示。 实验结果表明， 该方法敏 感性高， 特异性良好， 对人工感染动物试验样品 检测结果表明， mPCR与常规PCR方法检测结果一 致， 符合率为100％， 适用于禽病毒 性关节炎临床 诊断、 流行病学调查以及临床监测工作。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 114592088 A 2022.06.07 CN 114592088 A 1.一种用于检测或区分禽呼肠孤病毒(Avian  reovirus， ARV)4种不同基因型的多重 PCR引物组， 其特征在于， 所述的多重PCR引物组由1条通用上游引物mGC ‑F， 和分别用于扩增 ARV‑Ⅰ、 ARV‑Ⅰ‑sub、 ARV‑Ⅱ以及ARV‑Ⅴ特异性基因区域的4条特异性下游引物mGC1 ‑R、 mGC1‑ sub‑R、 mGC2‑R以及mGC5 ‑R组成， 其中上游引物mGC ‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 4条 特异性下游引物mGC1 ‑R、 mGC1‑sub‑R、 mGC2‑R以及mGC5 ‑R的核苷酸序列分别如SEQ  ID  NO.2‑5所示。 2.权利要求1所述的多重PCR引物组在制备检测或区分禽呼肠孤病 毒4种不同基因型的 试剂中的用途， 所述的ARV  4种不同基因型包括ARV ‑Ⅰ、 ARV‑Ⅰ ‑sub、 ARV‑Ⅱ以及ARV‑Ⅴ。 3.一种用于检测或区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型的多重PCR试剂盒， 其特征在于， 所述的试剂盒中含有权利要求1所述的多重PCR引物组。 4.如权利要求3所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述的试剂 盒用于检测或区分禽呼肠孤病 毒4种不同基因型时， 其反应体系为25.0 μL， 包括Ex  Taq预混酶12.5 μL， 上游引物mGC ‑F 1.0 μL， 下游引物mGC1 ‑R 1.0 μL、 下游引物mGC1 ‑sub‑R 1.5 μL、 下游引物mGC2 ‑R 1.0 μL、 下游引 物mGC5‑R 1.5 μL， cDNA 2.0 μL， ddH2O4.5 μL。 5.如权利 要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 上游引物以及下游引物的浓度均为10 μm/ μ L。 6.如权利要求4所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述的试剂 盒用于检测或区分禽呼肠孤病 毒4种不同基因型时， 其反应程序为： 95℃  5min预变性， 95℃变性30s， 52℃退火30s， 72℃延 伸50s， 35个循环， 然后在72℃延伸10mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114592088 A 2一种用于 检测或区分禽呼肠孤病毒4种不同 基因型的多重PCR 试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种多重PCR试剂盒及其应用， 特别涉及一种用于检测或区分禽 呼肠 孤病毒4种不同基因型的多重PCR试剂盒及其应用。 本发明属于医药技 术领域。 背景技术 [0002]鸡病毒性关节炎是由禽呼肠孤病毒(Avian  reovirus， ARV)感染导致的一种以鸡 关节肿胀、 跛行等为主要特征的禽免疫抑制病。 近年来， ARV感染和流行情况呈不 断加重的 趋势， 并且传播速度快、 波及范围广， 病 鸡感染后表现关节肿胀、 腱鞘炎、 跛行等症状， ARV感 染可诱发免疫抑制， 增强感染鸡群继发其他疾病的易感性， 常引起混合感染或继发感染， 死 亡率高达 30％～50％， 给我国养鸡业带来了严重的经济损失。 [0003]ARV是无囊膜的dsRNA病毒， 其基因组由10个节段组成。 其中S1基因编码的σ C蛋白 是病毒的外衣壳蛋白和主要保护性抗原， 与ARV的感染、 致病性和抗原变异关系密切。 σ C蛋 白编码基因可作为ARV 流行毒株 分型的依据， 根据其遗传 进化分析结果， ARV分离株可分为6 种基因型， 其中基因 Ⅰ型、 基因Ⅰ亚型、 基因 Ⅱ型和基因 Ⅴ型ARV为我国ARV流行的优势基因 型。 临床样品检测发现， 同一个养殖场不同基因型毒株共感染或混合感染现象较为常见， 因 此， 建立一种高效、 快速的鉴别诊断方法是十分必要的。 [0004]ARV特异性抗原检测方法是我国目前临床上比较常用的抗原检测方法， 但该方法 不能区分病毒基因分型， 且检测结果假阳性率比较高。 而像荧光定量、 间接免疫荧光实验、 病毒分离等抗原检测方法， 因其操作繁琐、 对实验仪器要求高、 耗时长的局限性， 也不利于 大批量样品的检测。 [0005]本发明建立并优化了一个用于区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型的多重PCR检测 方法， 该多重PCR检测方法快速、 特异性好、 敏感性高， 适用于禽病毒性关节炎临床诊断、 流 行病学调查以及临床监测工作。 发明内容 [0006]本发明的目的之一在于提供一种用于检测或 区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型的 多重PCR引物组； [0007]本发明的目的之二在于提供一种含有上述多重PCR引物组的， 用于检测或 区分4种 不同禽呼肠孤病毒基因型的多重PCR试剂盒； [0008]本发明的目的之三在于提供上述多重PCR引物组和试剂盒在检测或 区分禽呼肠孤 病毒4种不同基因型中的用途。 [0009]为了达到上述目的， 本发明采用了以下技 术手段： [0010]本发明的一种用于检测或区分禽呼肠孤病毒4种不同基因型的多重PCR引物组， 所 述的多重PCR引物组 由1条通用上游引物mGC ‑F， 和分别用于扩增 ARV‑Ⅰ、 ARV‑Ⅰ‑sub、 ARV‑Ⅱ 以及ARV‑Ⅴ特异性基因区域的4条特异性下游引物mGC1 ‑R、 mGC1‑sub‑R、 mGC2‑R以及mGC5 ‑R说　明　书 1/5 页 3 CN 114592088 A 3