(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210140285.3 (22)申请日 2022.02.16 (71)申请人 哈尔滨中科基因技 术有限公司 地址 150028 黑龙江省哈尔滨市松北区创 新一路2345号 三楼A区 (72)发明人 赵阳　魏启超　武守霖　孙彩云　 袁丹阳　董雪莹　 (74)专利代理 机构 哈尔滨市晨晟知识产权代理 有限公司 23219 专利代理师 刘坤 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的 引物探针组、 试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明涉及用于PRRSV和CSFV二重荧光定量 PCR检测的引物探针组、 试剂盒及检测方法， 属于 分子生物学技术领域。 为进一步提高PRRSV和 CSFV二重荧光定量PCR联检的准确性， 本发明提 供了用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的 引物探针组， 以PRRSV的ORF6基因和CSFV的5 ′UTR 非编码区作为扩增靶区域 设计的针对PRRSV的引 物探针组和针对CSFV的引物探针组， 保证了检测 基因位点的保守性和稳定性， 引物探针组序列结 构不存在相互作用， 扩增 效率和结合率高， 具有 很高的检测敏感性。 本发明提供的检测试剂盒同 相似病原 体无交叉反应， 具有较高的特异性和准 确性， 能满足大批量快速鉴别检测的要求。 权利要求书2页 说明书13页 序列表3页 附图3页 CN 114540546 A 2022.05.27 CN 114540546 A 1.一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的引 物探针组， 其特征在于， 包括针对 PRRSV的引物探针组和针对CSFV的引物探针组； 所述针对PR RSV的引物探针组包括具有如下核苷酸序列的引物和探针： 正向引物PR RSV‑D1‑F： 5′ ‑ACCTGGAAATTCATCACCTC‑3′； 反向引物PR RSV‑D1‑R： 5′ ‑CGACAAATGCGTGGTTATCA‑3′； 探针PRRSV‑Probe： 5′ ‑FAM‑TGCTAGGCCGCAAGTACATTC‑BHQ1‑3′； 所述针对CSFV的引物探针组包括具有如下核苷酸序列的引物和探针： 正向引物CSFV ‑D155‑18F： 5′ ‑GGGTGGTCTAAGTCCTGA‑3′； 反向引物CSFV ‑D325‑18R： 5′ ‑CTAATAGTGGGCCTCTGC‑3′； 探针CSFV ‑Probe： 5′ ‑ROX‑CAGTAGTTCGACGTGAGCAGA AG‑BHQ2‑3′。 2.一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1 所述的正向引物PRRSV ‑D1‑F、 反向引物PRRSV ‑D1‑R、 探针PRRSV ‑Probe、 正向引物CSFV ‑ D155‑18F、 反向引物CSFV ‑D325‑18R和探针CSFV ‑Probe。 3.根据权利要求2所述一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的试剂盒， 其特征 在于， 还包括DNA聚合酶、 逆转录混合酶、 阴性对照品、 PRRSV和CSFV的阳性对照品以及含有 dNTP的PCR缓冲液。 4.根据权利要求3所述一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的试剂盒， 其特征 在于， 所述PRRSV和CSFV的阳性对照品为PRRSV病毒的阳性质粒与CSFV病毒的阳性质粒的混 合品， 所述混合品 中PRRSV病毒的阳性质粒与CSFV病毒的阳性质粒的浓度均为2.4 ×10‑4ng/ ul； 所述阴性对照品为无菌DEPC ‑H2O。 5.根据权利要求4所述一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的试剂盒， 其特征 在于， 所述PRRSV病毒的阳性质粒是以PRRSV  ORF6基因序列保守片段中如SEQ  ID No.7所示 的核苷酸序列为靶目标序列扩增所得产物与载体连接构建的重组质粒， 扩增所用引物对具 有如下核苷酸序列： PRRSV‑SF： 5′ ‑TTTCAGCGGAACAATGGGGTC‑3′； PRRSV‑SR： 5′ ‑TTTCTGCCACCCAACACGAGG‑3′； 所述CSFV病毒的阳性质粒是以CSFV  5′UTR基因序列保守片段中如SEQ  ID No.10所示 的核苷酸序列为靶目标序列扩增所得产物与载体连接构建的重组质粒， 扩增所用引物对具 有如下核苷酸序列： CSFV‑S149‑18F； 5′ ‑CTCCCTGGGTGGTCTAAG‑3′； CSFV‑S729‑18R； 5′ ‑GCTACCTGTCACCCTACC‑3′。 6.一种用于PR RSV和CSFV二重荧 光定量PCR检测的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 步骤一、 提取待测 样本的基因组， 以所得基因组RNA为模板， 利用权利要求1所述引物探 针组进行二重RT ‑PCR扩增， 并在每 个循环延伸结束时进行荧 光信号检测； 步骤二、 对步骤一扩增所得PCR产物进行分析， 基于特定扩增曲线生成情况及Ct值判断 待测样本是否含有PR RSV和/或CSFV。 7.根据权利要求6所述一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的方法， 其特征在 于， 步骤一所述二重RT ‑PCR扩增反应体系中含有终浓度均为0.2 μM的正向引物PRRSV ‑D1‑F、 反向引物PRRSV ‑D1‑R、 正向引物CSFV ‑D155‑18F和反向引物 CSFV‑D325‑18R， 终浓度均为0.4权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114540546 A 2μM的探针PRRSV ‑Probe和探针CSFV ‑Probe， PCR缓冲液10 μl， 5U/ μl的DNA聚合酶0.4 μl， 逆转 录混合酶0.4 μl， 扩增模板2 μl， RNase  Free dH2O补足至总体积20 μl。 8.根据权利要求7所述一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的方法， 其特征在 于， 步骤一所述二重RT ‑PCR扩增反应程序为第一阶段： 反转录42℃5min， 预变性95℃10s， 1 个循环； 第二阶段： 95℃5s， 6 0℃34s， 共40个 循环。 9.根据权利要求8所述一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的方法， 其特征在 于， 步骤一荧光信号检测的探针检测模式设置为： 荧光模式PRRSV设为FAM/NONE双标记模 式， CSFV设为ROX/NONE双标记模式。 10.根据权利要求9所述一种用于PRRSV和CSFV二重荧光定量PCR检测的方法， 其特征在 于， 步骤二检测结果判断方法为： 若在FAM/NONE双 标记模式和ROX/NONE双 标记模式下均出现特定的扩增曲线， 且Ct值≤ 36.0， 则判定待测样本中同时存在PR RSV和CSFV； 若仅在FAM/NONE双标记模式下出现特定的扩增曲线且Ct值≤36.0， 则判定待测样本中 存在PRRSV； 若仅在ROX/NONE双标记模式下出现特定的扩增曲线且Ct值≤36.0， 则判定待测样本中 存在CSFV； 若FAM/NONE双标记模式和ROX/NONE双标记模式均未出现特定的扩增曲线， 且Ct值＞ 39.0或无Ct， 则判定待测样本中不存在PR RSV和CSFV； 若FAM/NONE双标记模式和/或ROX/NONE双标记模式出现特定的扩增曲线， 但36.0＜Ct 值≤39.0， 则需重复检验。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114540546 A 3